《BioDesign Research》：Efficient synthesis of optically pure D-lactate from mixed sugars by engineered
E. coli consortium
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本研究針對碳分解代謝物抑制(CCR)效應限制混合糖利用效率的難題，通過代謝工程構建了葡萄糖專化型(GL10)和木糖專化型(XL12)大腸桿菌，形成分工協作的合成菌群。該菌群在混合糖發酵中實現了葡萄糖完全消耗和53.21%木糖利用率，D-乳酸產量達3.76 g/L（較野生型提高5.96倍），光學純度達100%。研究通過調控搖床轉速(50-250 rpm)和接種比例(1:1至1:15)，優化發酵性能，并在玉米秸稈水解液中驗證其應用潛力，為生物基D-乳酸生產提供了新策略。
隨著全球對可持續發展和生物基材料需求的日益增長，聚乳酸(PLA)作為一種可生物降解的聚合物，在替代石油基塑料方面展現出巨大潛力。其中，立體復合聚乳酸(SC-PLA)由D-乳酸和L-乳酸共聚而成，具有優異的熱穩定性和機械性能，但其工業化應用受限于高光學純度D-乳酸的規模化生產瓶頸。目前，化學合成法生產的乳酸為外消旋混合物，需要復雜的手性分離工藝，而微生物發酵法雖能直接合成光學純乳酸，卻面臨碳分解代謝物抑制(CCR)效應導致的混合糖利用效率低下問題。特別是木質纖維素水解液中含有葡萄糖和木糖等混合糖，如何實現其協同高效轉化成為生物制造領域的關鍵挑戰。
為解決這一難題，湖北大學生命科學學院的研究團隊在《BioDesign Research》發表論文，通過合成生物學策略構建了人工大腸桿菌菌群，實現了混合糖向光學純D-乳酸的高效轉化。研究采用CRISPR/Cas9基因編輯技術對大腸桿菌BL21(DE3)進行代謝工程改造，敲除副產物合成途徑關鍵基因（如丙酮酸甲酸裂解酶pflB、磷酸轉乙酰酶pta等），構建了葡萄糖專化型菌株GL10和木糖專化型菌株XL12。通過實時熒光定量PCR(qRT-PCR)驗證基因敲除效果，利用高效液相色譜(HPLC)分析代謝產物，并系統評估了搖床轉速、接種比例等發酵參數對菌群性能的影響，最終在玉米秸稈水解液中驗證其工業化應用潛力。
3.1. 菌株構建
通過CRISPR/Cas9技術成功構建XL12（缺失glk、ptsI等11個基因）和GL10（缺失pps、poxB等8個基因）工程菌。qRT-PCR分析顯示，XL12中磷酸葡萄糖異構酶pgi、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc等基因表達顯著下調，表明代謝流成功導向D-乳酸合成。
3.2. 木糖利用菌株發酵性能
階段性構建的中間菌株XL5（缺失glk等5個基因）在葡萄糖培養基中生長延遲，但能將D-乳酸產量提升至2.66 g/L（轉化率53.2%）。升級版XL12在木糖為唯一碳源時產量達2.66 g/L，且副產物（琥珀酸、甲酸等）未檢出。在混合糖發酵中，XL12可同步利用56.57%木糖，但葡萄糖仍對木糖利用存在抑制。
3.3. 葡萄糖利用菌株發酵性能
GL10在葡萄糖培養基中產量達3.15 g/L（轉化率63%），光學純度100%。但在混合糖體系中，盡管葡萄糖快速消耗，木糖利用率幾乎為零，表明單一菌株策略難以克服CCR效應。
3.4. 混合糖共發酵
GL10與XL12以1:1比例形成的菌群在36小時內實現葡萄糖完全消耗和53.21%木糖利用，D-乳酸產量較野生型提高5.96倍。提高搖床轉速至250 rpm可促進菌體生長，但D-乳酸產量在150 rpm時最優（3.76 g/L），表明溶解氧水平調控碳流分配。當接種比例調整為GL10:XL12=1:5時，產量進一步提升至4.53 g/L，但過量XL12可能因能量代謝限制抑制木糖利用。
3.5. 玉米秸稈水解液驗證
菌群在脫毒處理后的水解液中產量達5.15 g/L，較野生型提高41.87%，證明其在實際原料中的適用性。但發酵后期pH降至4.5-5.0，提示酸耐受性改良是未來優化方向。
該研究通過代謝分工策略成功規避了單菌系統的代謝沖突，首次實現了工程菌群在混合糖中同步高效轉化D-乳酸。其創新性在于：通過精確敲除磷酸轉移酶系統(PTS)關鍵基因glk/ptsI，重塑木糖代謝網絡；利用菌群互補性克服CCR效應；發現溶解氧與接種比例對代謝流的調控規律。研究成果為木質纖維素生物煉制的工業化提供了關鍵技術支撐，也為復雜底物利用的合成生態系統設計提供了范式參考。未來通過整合酸耐受性改造與過程優化，有望進一步提升D-乳酸的經濟性。
