骨肉瘤（OS）是兒童和青少年中最常見和最具侵襲性的原發性惡性腫瘤，給骨科臨床治療帶來了重大挑戰[1]。骨骼的解剖結構復雜性使得通過傳統手術方法進行完全切除變得復雜，而高劑量的化療藥物往往會導致嚴重的全身副作用和藥物耐藥性[2]。因此，當前的臨床治療方法仍然不令人滿意，殘疾率和死亡率仍然很高[3]。近年來，免疫療法已成為治療各種實體瘤的有效方法；然而，OS的免疫抑制微環境和高異質性限制了其效果[4]，[5]。此外，腫瘤切除后的大量骨質流失通常需要定制的骨科植入物[6]�；�療后自身免疫力的下降以及部分開放的傷口進一步增加了植入物相關感染（IAIs）的風險[7]，[8]。因此，迫切需要開發能夠有效根除OS的同時預防術后IAIs的高效治療平臺[9]，[10]。

最近，鐵死亡被確定為一種新的程序性細胞死亡方式，其特征是對鐵的依賴性和有毒脂質過氧化物的細胞內積累[11]，[12]。細胞代謝和氧化還原穩態的失衡可以有效地誘導腫瘤細胞中的免疫原性細胞死亡（ICD），從而產生有效的適應性細胞免疫[13]，[14]。值得注意的是，類似鐵死亡的死亡方式也對浮游細菌和細胞內細菌感染有效，從而增強了適應性抗菌免疫[15]。因此，誘導鐵死亡的策略被認為是治療OS及其術后感染的潛在替代干預措施[16]，[17]。然而，局部OS微環境中普遍存在的還原劑谷胱甘肽（GSH）水平升高會抵消氧化應激并降低鐵死亡的效果[18]，[19]。在這種情況下，核因子紅系2相關因子2（Nrf2）通過調節抗氧化酶（如谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）以及參與GSH合成的基因（如溶質載體家族7成員11（xCT））來維持氧化還原平衡[20]，[21]。在鐵死亡過程中，Nrf2通過上調GPX4和xCT的表達水平來增強細胞對氧化應激的耐受性并抵抗鐵死亡[22]，[23]。因此，作為上游調控因子，特異性抑制Nrf2在腫瘤內部和外部促進鐵死亡具有重大潛力[24]。

簇狀規律間隔短回文重復序列相關蛋白9（CRISPR-Cas9）技術作為一種先進的“魔剪”基因組編輯工具，提供了通過高效精確基因組重編程治療重大疾病的前沿機會[25]，[26]。利用CRISPR-Cas9技術敲低Nrf2基因是一種可行的策略，可以抑制氧化應激能力并增強鐵死亡的效果[27]。然而，通過確保在特定刺激下對CRISPR-Cas9從基因組編輯載體中的釋放進行時空控制，對于減輕基因毒性至關重要[28]，[29]，[30]。熱刺激誘導的表達已被證明是一種有效調節目標基因的方法；具體來說，熱休克蛋白70（HSP70）啟動子在熱應力條件下高度激活，當溫度達到 certain 閾值（41-42°C）時，會迅速啟動下游基因表達[31]，[32]，[33]。這使得CRISPR-Cas9系統能夠在指定的時間點或條件下優化表達。與傳統的近紅外I（NIR-I）光熱療法（PTT）相比，新興的近紅外II（NIR-II）PTT由于更深的組織穿透力和較低的光毒性風險而顯示出更好的熱可控潛力[34]，[35]。因此，使用NIR-II高溫誘導的HSP70-CRISPR-Cas9系統對于特異性抑制Nrf2具有很大的前景。

在這項研究中，我們開發了一種熱可控的基因組編輯納米平臺BF/pHCN，旨在消除OS腫瘤并預防術后IAIs，同時重新編程免疫抑制微環境（圖1）。首先，我們構建了一種CRISPR/Cas9治療質粒Cas9-sgNrf2，以及上游的HSP70啟動子序列（HSP70-Cas9-sgNrf2，命名為pHCN）。隨后，將Fe(II)加載到苯硼酸（PBA）修飾的NIR-II PTT有機納米載體BTP中（BTP@Fe，命名為BF）；然后通過核糖與PBA基團之間的動態硼酸酯鍵以及電荷吸引機制將pHCN與BF結合。使用DSPE-mPEG₂₀₀₀共同組裝，形成了最終的納米平臺BF/pHCN。生成的BF/pHCN通過細胞內化過程選擇性地在OS細胞內積累，并在酸性微環境中釋放Fe(II)。值得注意的是，在42°C的NIR-II激光照射下，熱激活誘導了HSP70啟動子，準確促進了Cas9蛋白表達，抑制了Nrf2基因組序列，同時促進了Fe(II)的釋放，最終破壞了OS細胞內的氧化應激狀態并引發了鐵死亡。此外，增強的鐵死亡完全引發了ICD，從而改善了極化的促炎巨噬細胞，促進了樹突狀細胞（DCs）的成熟，并激活了細胞抗腫瘤免疫。此外，BF/pHCN還對浮游細菌表現出直接的殺菌活性，并通過針對巨噬細胞的鐵代謝紊亂策略有效消除了細胞內細菌，從而啟動了適應性抗菌免疫。總體而言，這些發現驗證了我們的創新NIR-II熱可控基因組編輯納米平臺BF/pHCN表現出顯著的抗腫瘤特性以及強大的抗感染和免疫調節能力，為有效管理OS和預防術后IAIs和復發提供了可行的策略。