《Bioresource Technology Reports》：Engineering microbial cells for optimal biohydrogen production: a concise review of process control and metabolic engineering
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本綜述系統探討了通過代謝工程（ME）和基因組編輯技術（如CRISPR-Cas9）提升微生物暗發酵（DF）生物制氫（BioH2）產量的前沿策略。文章重點分析了消除競爭途徑（如敲除ldhA、frdD基因）、解除碳分解代謝阻遏（CCR）以促進混合糖利用、以及重定向代謝流（如過表達Mdh、MaeA、[Fe-Fe]氫酶）等關鍵方法。同時，綜述還評估了過程工程參數優化以減輕產物毒性（如VFAs抑制）的策略，并展望了結合多組學數據和機器學習模型推動BioH2工業化應用的未來方向。
1. 引言
全球能源需求的激增以及對化石燃料的嚴重依賴，是導致全球變暖的主要因素。在此背景下，源自可再生資源的清潔能源——生物氫（BioH2），因其高熱值和生產利用過程中的零碳排放特性而備受關注。在各種生物制氫技術中，微生物暗發酵技術展現出利用可再生生物質生產高氫產量的巨大潛力。然而，盡管付出了巨大努力，許多暗發酵過程仍難以達到理想的氫氣產率。代謝工程和基因組工程為改造微生物、提高發酵過程中的氫氣生產率提供了強大工具。本綜述旨在闡述該領域的研究現狀，重點討論通過代謝和基因組工程增強生物制氫能力的策略。
2. 生物制氫的代謝工程方法
野生型產氫微生物的氫氣產量通常低于其理論潛力。代謝工程通過精確操控細胞過程，可開發出具有增強產氫能力的新表型。關鍵策略包括消除競爭途徑、解除碳分解代謝阻遏以及重定向代謝流。
2.1. 消除競爭途徑
產氫細菌會產生乙酸、乙醇、乳酸和甲烷等競爭性副產物，這些副產物會分流碳、能量和電子，從而降低整體氫產量。通過敲除特定基因，如編碼富馬酸還原酶的frdD基因和編碼乳酸脫氫酶的ldhA基因，可以顯著提高氫產量。例如，在大腸桿菌（Escherichia coli）中敲除這兩個基因可使H2產量比野生型提高2.5倍。此外，調控甲酸代謝（例如通過操縱focA基因）和修飾NADH途徑（例如通過移除FHL阻遏蛋白編碼基因hycA）也是有效的策略。
2.2. 解除碳分解代謝阻遏以實現混合糖利用
木質纖維素等生物質原料含有多種糖類，但微生物通常存在碳分解代謝阻遏（CCR）現象，即優先利用葡萄糖等優選碳源，限制了其他碳源（如木糖、阿拉伯糖）的產氫能力。通過敲除磷酸轉移酶系統（PTSGlc）的相關基因（如ptsG, crr, ptsI, ptsH），或刪除araC等調控基因，可以解除CCR，實現葡萄糖和木糖等糖類的同步消耗，從而有效提高氫氣產量。
2.3. 重定向代謝流
該策略旨在引導碳、能量和還原力（如NADH）流向產氫途徑，同時減少不必要的副產物。代謝流分析（MFA）是理解和優化這一過程的關鍵工具。通過基因刪除研究結合基因組尺度模型，可以預測和優化代謝途徑。研究表明，調節水力停留時間（HRT）和pH值等參數可以影響代謝流，進而影響氫產量。將代謝工程工具與基因組編輯方法相結合，有望在工業條件下實現穩定高效的產氫。
3. 基因組編輯方法：CRISPR-Cas基因組編輯工具
與傳統代謝工程工具相比，CRISPR-Cas系統因其高遺傳穩定性、較低的技術復雜性和強大的放大穩定性而受到更多關注。該系統能夠對微生物基因組進行精確、高效的遺傳修飾。例如，利用CRISPR-Cas9技術敲除產氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes）IAM1183的nuoC, nuoD, nuoE等NADH脫氫酶亞基基因，可分別使產氫量提高24.5%和45.6%。該技術還可用于過表達[Fe-Fe]氫酶、抑制[Ni-Fe]氫酶、敲除乳酸脫氫酶（Ldh）等，以增強發酵產氫。然而，CRISPR-Cas在某些嚴格厭氧菌（如梭菌屬Clostridium spp.）中的應用仍面臨轉化和編輯效率低、Cas蛋白毒性以及工程菌株在大型生物反應器中長期穩定性等挑戰。
4. 重組基因表達策略
重組基因表達是通過在宿主生物中引入并表達目的基因來生產特定蛋白質或代謝產物的關鍵技術，包括同源基因表達和異源基因表達。
4.1. 同源基因表達
該策略通過過表達宿主自身的產氫關鍵基因（如氫酶基因）來增強產氫。例如，過表達蘋果酸脫氫酶（Mdh）和蘋果酸酶A（MaeA）可引導碳流向丙酮酸，進而促進H2合成。在產氣腸桿菌中過表達甲酸氫裂解酶激活因子基因fhlA，能顯著提高FHL活性，從而使利用棉稈水解液的產氫量提高188%。類似策略在腸桿菌屬、埃希氏菌屬、梭菌屬和克雷伯氏菌屬中均有成功應用。
4.2. 異源基因表達
該策略將外源基因引入宿主菌，以賦予或增強其產氫能力。例如，將大腸桿菌的非編碼RNA RyhB異源表達于克雷伯氏菌中，可使產氫率提高近50%。將肺炎克雷伯氏菌的nadE基因（參與NADH途徑）在產氣腸桿菌中表達，可增加NADH可用性，從而將代謝流導向產氫。將來自莢膜紅細菌（Rhodospirillum rubrum）的[Fe-Fe]氫酶基因及其成熟蛋白基因在大腸桿菌中共表達，也能顯著提高氫酶活性和產氫量。不過，異源表達體系的遺傳穩定性和效率仍是需要持續研究的問題。
5. 增強底物利用
底物利用效率對暗發酵產氫至關重要。利用代謝工程改造微生物，使其能夠直接降解木質纖維素等復雜生物質并產氫，可以減少預處理步驟，降低成本。例如，從牛瘤胃中分離并改造的大腸桿菌ZH-4菌株，能夠降解玉米秸稈中的纖維素和半纖維素，并從中產氫。此外，利用粗甘油、有機城市固體廢物、啤酒糟、糖蜜和腐爛椰棗等廢料作為底物生產氫氣，也為廢物資源化提供了新途徑。補充氨基酸等營養物質也被證明可以優化底物利用，提高產氫量。
6. 優化工藝工程參數以降低毒性
產物毒性是規模化微生物產氫的主要障礙之一。在暗發酵階段產生的揮發性脂肪酸（VFA）、氨、硫化物、重金屬離子以及預處理過程中產生的呋喃醛、酚類等抑制劑，會嚴重抑制微生物生長和產氫活性。工藝優化策略主要包括稀釋和去除抑制劑、滅活抑制劑以及調整操作參數。
6.1. 稀釋和去除抑制劑
通過定期更換部分發酵液（如30%-50%）以稀釋積累的VFA，可以緩解pH下降和產物抑制。使用生物炭吸附、電動力學、生物浸出等方法可有效去除重金屬離子。補充鐵離子（Fe2+）可以沉淀硫離子，減輕硫化物毒性。
6.2. 滅活抑制劑
采用酸處理、堿處理、熱處理或酶處理（如胰蛋白酶）等方法，可以滅活或降解硫代硫酸鹽、細菌素、酚類化合物等抑制劑。利用基因工程微生物直接轉化利用這些抑制劑，也是一種經濟有效的方法。
6.3. 調整操作參數
優化碳氮比（C/N）、食物微生物比（F/M）、pH值、溫度、攪拌速度等參數至關重要。例如，將pH維持在6.2-6.8范圍內可抑制硫酸鹽還原菌和甲烷菌的活性。熱休克處理（55-65°C，30分鐘）或施加40 mV外部電壓也能有效抑制甲烷菌。在優化條件下（如37°C，200 rpm），工程菌株能實現更高的產氫效率。
7. 結論與未來展望
代謝工程和基因組編輯技術為大幅提高生物制氫效率提供了強大動力。通過消除競爭途徑、解除碳分解代謝阻遏、重定向代謝流以及應用CRISPR-Cas9等工具，已在實驗室和中試規模上取得了顯著進展。未來研究應側重于：利用多組學數據和機器學習模型深入理解并優化細胞系統；開發混合途徑工程和合成微生物群落；解決氫酶氧敏感性問題；探索經濟有效的毒性抑制物綜合緩解策略；以及將遺傳改造與工藝參數優化緊密結合。這些努力將推動生物制氫技術的工業化進程，為環境可持續的清潔能源未來做出貢獻。
