《Current Opinion in Microbiology》：Genetic toolbox development for engineering
Bacteroides and other bacterial species
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本綜述系統探討了非模式細菌（特別是擬桿菌屬）合成生物學工具箱的開發策略，重點介紹了遺傳元件傳遞與維持、可控基因表達、基因組編輯及先進工具應用等關鍵技術，為工程化活體療法和診斷工具的開發提供了重要方法論指導。
引言
微生物工程與合成生物學的交叉領域正在重塑生物醫學研究的格局。傳統研究多聚焦于實驗室常用菌株的改造，但近年來，利用非模式共生菌和益生菌開發原位工程化活體治療或診斷機器的興趣日益濃厚。擬桿菌屬作為人類腸道微生物組中的優勢菌群，因其低致病性、持久定植能力和宿主適應性成為理想工程化平臺。然而，有效遺傳操作新物種常需開發新工具，這推動了針對非模型細菌的合成生物學工具箱的快速發展。
遺傳元件的傳遞與維持
實現微生物工程化功能的首要步驟是建立遺傳物質向目標菌株的高效傳遞和穩定維持系統。質粒作為最常用的遺傳載體，其基本功能依賴于復制起點（Ori）和選擇標記。隱性質粒（如擬桿菌中的pBI143）是Ori的重要來源，但通常需要構建大腸桿菌-擬桿菌穿梭載體以確保在克隆宿主和目標菌株中的功能性。對于轉化效率低的細菌（如擬桿菌），接合轉移成為主要遞送方法，需要載體包含轉移起點（OriT）并使用特定供體菌株（如E. coli S17–1 λpir）。
選擇標記方面，抗生素抗性基因（如紅霉素、四環素抗性基因）最為常用，其適用性可通過藥敏試驗或基因組生物信息學預測確定。替代策略是營養缺陷型互補，通過刪除必需代謝基因并在質粒上反式補充，將質粒維持與生長優勢耦合，這種方法可避免抗生素抗性基因的環境擴散，更適用于臨床。此外，基因組整合能實現遺傳元件的穩定維持，無需持續施加選擇壓力，并降低質粒高拷貝復制帶來的代謝負擔，同時通過避免染色體外質粒的水平基因轉移提高生物安全性。
可控基因表達
精確調控基因表達是工程化微生物的核心。轉錄啟動子和核糖體結合位點（RBS）的選擇決定了蛋白表達的水平和可調性。擬桿菌的RBS缺乏典型的Shine-Dalgarno（SD）序列，其翻譯起始更依賴于核糖體蛋白結合而非SD序列-16S rRNA相互作用，因此RBS強度的預測準確性較低。解決方案包括從高表達蛋白中挖掘天然強效RBS或篩選隨機序列文庫。
啟動子可分為組成型和誘導型。通過轉錄組學分析在不同培養條件下持續高表達的基因，可鑒定其啟動子用于構建組成型表達工具。例如，在擬桿菌中已鑒定出一系列強度各異的組成型啟動子。噬菌體基因組也是強效啟動子的重要來源，如源自B. fragilis靶向噬菌體的PBfP1E6啟動子是當前擬桿菌中最強的組成型啟動子。
對于需要精確時空調控的應用，誘導型啟動子至關重要。天然誘導型啟動子可通過轉錄組學分析細菌在特定誘導物（如不同碳源）處理下的差異表達基因來發現。例如，在B. thetaiotaomicron中已開發出對甘露聚糖、葡聚糖、鼠李糖和阿拉伯半乳聚糖響應的天然誘導系統。此外，廣宿主范圍的調控系統（如LacI/lacO、TetR/tetO）可通過在組成型啟動子中插入操作子序列來構建合成誘導型啟動子，實現在擬桿菌中對IPTG、脫水四環素（aTC）、膽汁酸和亞硝酸鹽/硝酸鹽的響應。
基因組修飾
基因組編輯工具可實現基因敲除、突變及穩定整合，是微生物工程的高級手段。等位基因交換利用同源重組（HR）和“自殺載體”介導靶向基因替換，載體設計包含同源臂、選擇標記及（如需無痕編輯）反選擇標記。該方法已用于擬桿菌的疤痕基因組工程。
整合酶系統（如絲氨酸/酪氨酸整合酶）介導質粒在預定義位點（如attB位點）的特異性基因組整合。常用的擬桿菌基因組整合載體包括pNBU1和pNBU2，它們可用于插入基因表達盒甚至實現基于重組酶的遺傳記憶功能。轉座子則介導近乎隨機的基因組插入，適用于大規模誘變和功能基因組學研究。在擬桿菌中，轉座子誘變已用于鑒定與適應性相關的必需基因及特定表型相關基因。
CRISPR/Cas系統因其宿主非依賴性的核酸酶活性和通用DNA修復機制，已成為細菌基因組編輯的強大工具。其可編程性允許高效、多位點編輯，且無需選擇標記。CRISPR/Cas系統已被整合到大腸桿菌-擬桿菌穿梭載體中，在多種擬桿菌中實現高效率的基因插入、刪除和堿基編輯。最近，CRISPR/Cas系統與轉座酶結合，實現了大型多基因操作子在原生小鼠B. thetaiotaomicron體內的原位插入，展示了其治療應用潛力。
先進工具開發與應用
復雜轉錄編程
將單個遺傳組件組合成復雜遺傳電路，可使微生物執行多輸入邏輯運算。例如，在擬桿菌中，多個誘導型啟動子與向導RNA表達耦合，通過催化失活Cas9（dCas9）介導的啟動子抑制，實現了布爾運算控制報告蛋白表達。更復雜的電路通過整合多組阻遏蛋白和抗阻遏蛋白，實現了更高級的邏輯運算和電路壓縮。這種能力促進了感知-響應系統的開發，為治療、診斷等應用提供了更精細的控制。
蛋白分泌與表面展示
許多應用需要工程化菌將蛋白載荷分泌到胞外或展示在細胞表面。革蘭氏陰性菌（如擬桿菌）的雙膜結構使其分泌系統更為復雜。早期研究利用B. fragilis腸毒素的信號肽，在B. ovatus中實現了木聚糖誘導的人角質細胞生長因子-2和轉化生長因子-β的分泌，成功緩解小鼠炎癥性結腸炎。近期，通過篩選B. thetaiotaomicron的內源性分泌蛋白，鑒定出一套擬桿菌分泌載體（信號肽和全長蛋白），實現了異源蛋白在擬桿菌屬中的高效分泌。
蛋白表面展示通常通過將 cargo 蛋白與錨定在外膜的天然蛋白（如脂蛋白、孔蛋白等）融合來實現。近期研究證實，通過將熒光蛋白與脂蛋白BT_2844和OmpF孔蛋白融合，可在B. thetaiotaomicron表面實現靶向展示。
生物傳感
轉錄調控因子、雙組分系統和核糖開關等生物元件常被用于構建細菌生物傳感電路。許多轉錄調控因子受特定化合物調控，為構建化合物特異性誘導型啟動子生物傳感器提供了資源。雙組分系統通過感應小分子配體激活靶基因表達。核糖開關是mRNA內的非編碼調控元件，結合配體后通過構象變化調控基因表達。盡管將擬桿菌開發為生物傳感器的興趣增長，但其可用的傳感模塊仍遠少于大腸桿菌，這仍是未來的重要目標。
結論與未來方向
細菌工程化工具箱的開發建立在基礎生物學研究之上，并推動著對新發現的探索。例如，近期B. thetaiotaomicron的高分辨率轉錄組學研究揭示了其基因組編碼的許多小RNA和核糖開關，可用于生物傳感和遺傳電路設計。雙膜跨抗σ因子（Dma）蛋白家族的發現為工程化新型生物傳感器（尤其是檢測無法進入細胞的大分子）提供了潛在靶點。
然而，將工程化益生菌和共生菌應用于治療診斷仍面臨挑戰，特別是菌株定植和生物防護。近期研究表明，通過CRISPR相關轉座酶介導的精確原位基因編輯，可能規避外源接種菌的定植限制。其他方法旨在完全避免使用遺傳物質，例如利用原生擬桿菌的木葡聚糖水解活性激活糖綴合物前藥。盡管擬桿菌是已知的共生菌，但許多物種被認為是機會致病菌，這需要通過更嚴格的生物安全措施和清晰的臨床監管指南來解決。基因組精簡或合成基因組構建可用于改善菌株的臨床適用性。因此，除了優化遺傳電路以實現更復雜的功能外，將這些修飾生物體安全有效地應用于實驗室之外，還需要嚴格的工程化控制策略。
