微生物食品安全仍然是一個緊迫的全球性挑戰，細菌病原體對公共健康和食品系統穩定性構成重大風險（Madilo等人，2024年；Unnevehr，2022年）。單核細胞增生李斯特菌是最危險的食源性病原菌之一，由于其能夠在冷藏溫度下繁殖并在食品加工環境中持續存在，因此屬于需要控制的五大食源性病原菌之一（歐洲食品安全局和歐洲疾病預防控制中心，2023年；Tuytschaever等人，2023年；Vidovic等人，2024年）。當單核細胞增生李斯特菌進入人體時，會引起李斯特菌病，癥狀從惡心到腦膜炎不等（Wai等人，2020年）。單核細胞增生李斯特菌對免疫系統較弱的人、孕婦、嬰兒和老年人尤其危險（歐洲食品安全局，2025年）。當衛生和流行病學標準未得到執行時，單核細胞增生李斯特菌經常存在于食品生產中并污染食品（Vidovic等人，2024年）。南非最大的食源性疾病暴發歸因于單核細胞增生李斯特菌（Olanya等人，2019年），導致數百人死亡，這突顯了快速、準確和可獲得的診斷工具的迫切需求。盡管有現有的監管努力，但食源性病原體在供應鏈中的持續存在往往與監測不足、衛生習慣差以及食品處理人員缺乏意識有關。因此，敏感可靠的診斷系統對于及時檢測和預防污染至關重要，有助于提高微生物安全性和公共健康保護。
大多數法規要求在即食食品中檢測非常低的細胞濃度（100 CFU/g），或零容忍水平（25克中未檢測到），這一點得到了美國食品藥品監督管理局（FDA）、美國農業部食品安全檢驗服務局（FSIS）和歐盟委員會（EC）的支持（2024年11月20日的委員會法規（EU）2024/2895號，修訂了關于單核細胞增生李斯特菌的法規（EC）第2073/2005號；Farber等人，2021年）。通過選擇培養基上的細胞生長和分析，可以確保適當的靈敏度（Jones & D'Orazio，2013年）。所選方法的靈敏度可以顯著減少細胞生長所需的時間。因此，PCR和等溫擴增方法可以在反應中達到單細胞的靈敏度（Kabiraz等人，2023年；Osek等人，2022年），從而大大縮短了細胞生長所需的時間。
由于等溫擴增方法的發展，食源性病原菌的分子診斷技術取得了顯著進展，這些方法可以在固定溫度下指數級增加目標DNA的拷貝數（Feng等人，2025年）。其中最流行的等溫擴增類型是環介導等溫擴增（LAMP），該方法使用四到六個引物在恒定溫度下復制目標DNA，無需熱循環儀，從而實現快速高效的擴增。LAMP可以在30-60分鐘內達到與PCR相當的靈敏度（Nagamine等人，2002年）。對于單核細胞增生李斯特菌，已知有幾種有效的LAMP系統可以檢測反應中的單個細胞（Cho等人，2014年；M.-J. Tang等人，2011年）。然而，LAMP檢測系統容易產生假陽性反應（Kim等人，2023年）。為了降低這些風險，可以使用CRISPR（成簇規律間隔短回文重復序列）/Cas12a（CRISPR相關的內切酶Cas12a）系統，該系統可以識別雙鏈擴增產物（Zhou等人，2024年）。Cas12a是一種RNA引導的內切酶，可以特異性結合與短引導RNA（gRNA）互補的DNA序列并切割附近的單鏈DNA探針。這使得能夠分子識別LAMP產物并將DNA的存在轉化為可測量的信號。CRISPR/Cas12a具有雙重功能：它利用引導（g）RNA-Cas12a內切酶復合物來識別LAMP擴增產物中的特定DNA目標，并通過Cas12a對單鏈DNA探針的內切活性提高靈敏度。報道的一種單核細胞增生李斯特菌檢測系統結合了LAMP-CRISPR/Cas12a擴增和熒光檢測（Lee等人，2023年）。
除了靈敏度和特異性之外，快速、非儀器化的分析結果評估能力在單核細胞增生李斯特菌檢測中也是一個關鍵方面。在這方面，側向流動測試（LFT）作為一種特別可靠的工具脫穎而出。LFT是一種基于紙張的檢測方法，其中標記的核酸產物被捕獲在硝酸纖維素條上的特定區域，產生可見的顏色變化。這允許在沒有專用設備的情況下直接進行視覺檢測，使其適用于快速現場診斷（Younes等人，2024年）。最初作為免疫測定技術建立的LFT，由于等溫擴增方法的發展，越來越多地用于簡單和快速的核酸檢測（Budd等人，2023年；Lapee-e等人，2025年）。LFT檢測相比使用紫外線照射的非儀器化熒光檢測具有多個優勢，包括有控制區、正負樣本之間的清晰視覺區分、將分析結果存儲在測試條中、無需紫外線光源和黑暗環境。用于單核細胞增生李斯特菌檢測的LAMP-LFT測試系統基于將熒光素和生物素標簽引入引物，然后通過特異性抗熒光素抗體（anti-FAM）和鏈霉親和素在擴增產物中識別它們（Ledlod等人，2020年；Srisawat等人，2022年；Wachiralurpan等人，2017年）。在這些系統中，測試區的信號強度直接與樣本中存在的擴增產物數量相關。然而，LAMP-LFT的靈敏度通常低于使用儀器熒光檢測的方法，如SYBR GREEN染色。這種矛盾是由于LAMP擴增產物的異質性造成的，它們由包含重復目標序列的不同長度的擴增產物混合而成。較短的標記擴增產物比長的擴增產物更有利于LFT檢測（Safenkova, Kamionskaya, Zherdev, & Dzantiev，2025年）。將LFT檢測與LAMP-CRISPR/Cas12a系統結合可以克服傳統LAMP-LFT的局限性，因為CRISPR/Cas能夠識別短和長擴增產物中的DNA目標。然而，據我們所知，之前尚未有報道用于單核細胞增生李斯特菌檢測的LAMP-CRISPR/Cas12a-LFT測試系統。
缺乏用于單核細胞增生李斯特菌檢測的LAMP-CRISPR/Cas12a-LFT系統可能與傳統單鏈DNA探針的局限性有關，這種探針被激活的Cas12a切割后通過LFT檢測（Chen等人，2018年）。關鍵問題是檢測依賴于非切割探針在第一個結合區的完全結合，從而阻止金納米顆粒結合物遷移到第二個結合區。然而，存在一些結合物可能繞過第一個結合區并在第二個結合區結合，導致假陽性結果。因此，切割探針對于在測試區形成復合體并不是必需的。因此，這種分析方案削弱了LFT作為無儀器檢測方法的可靠性。幾項研究提出了替代傳統單鏈DNA探針的方案，以克服這些局限性（Ivanov, Safenkova, Zherdev, & Dzantiev，2022年；Safenkova, Kamionskaya, Ivanov等人，2025年；Y. Tang等人，2022年；Zuo等人，2025年）。基于這些研究，我們選擇了一種在5′端帶有三個FAM標簽、3′端帶有生物素標簽的叉形單鏈DNA（15dT）探針（三腳架探針）（Safenkova, Kamionskaya, Ivanov等人，2025年）。在探針被激活的Cas12a切割并與未切割探針分離后，帶有三個FAM標簽的切割部分在LFT的夾心格式中容易被檢測到（熒光素特異性抗體既固定在測試區也固定在金納米顆粒表面）。因此，帶有三個標簽的切割部分是測試區形成可檢測復合體的不可或缺的組成部分，確保信號強度與目標DNA濃度之間的直接相關性。
在這項研究中，我們開發了一種基于LAMP、CRISPR/Cas12a、叉形探針和LFT的無設備生物傳感器，用于高度敏感和特異性地檢測單核細胞增生李斯特菌（示意圖見圖1）。分析包括幾個步驟：樣品制備、DNA目標（hlyA基因）的LAMP擴增、CRISPR/Cas12a識別擴增產物中的雙鏈DNA目標并切割叉形探針、磁分離以去除未切割的探針，以及LFT檢測切割后的叉形探針。在樣本中存在單核細胞增生李斯特菌的情況下，測試區和控制區都會出現在測試條上；相反，在沒有單核細胞增生李斯特菌的情況下，只有控制區可見。據我們所知，這是首次報道使用LAMP-CRISPR/Cas12a-LFT進行快速、無儀器檢測單核細胞增生李斯特菌。此外，這項研究的發現首次使得可以使用同一組LAMP引物比較LAMP-LFT和LAMP-CRISPR/Cas12a-LFT的效力。開發的LAMP-CRISPR/Cas12a-LFT檢測方法已在牛奶樣本上成功測試。
