《Synthetic and Systems Biotechnology》：De novo biosynthesis of eriocitrin in
Saccharomyces cerevisiae through deep learning-guided enzyme screening and systematic metabolic engineering
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本研究針對植物提取法生產(chǎn)圣草枸軛苷（eriocitrin）存在的活性成分含量低、季節(jié)性限制等問題，通過深度學(xué)習(xí)指導(dǎo)的糖基轉(zhuǎn)移酶篩選、UDP-鼠李糖合成途徑重構(gòu)、UDP-葡萄糖供應(yīng)優(yōu)化及糖苷水解酶敲除等系統(tǒng)代謝工程策略，在釀酒酵母中首次實(shí)現(xiàn)了從葡萄糖從頭合成圣草枸櫞苷，產(chǎn)量達(dá)30.5 mg/L，為黃酮二糖的可持續(xù)微生物生產(chǎn)提供了新范式。
圣草枸櫞苷（eriocitrin）是一種具有抗氧化和抗炎活性的黃酮-7-O-二糖，在功能性食品和藥物領(lǐng)域應(yīng)用潛力巨大。然而，傳統(tǒng)植物提取法受限于活性成分含量低、季節(jié)性波動及復(fù)雜加工流程，化學(xué)合成則面臨有毒試劑、苛刻反應(yīng)條件和溶劑污染等工業(yè)瓶頸。面對這些挑戰(zhàn)，利用微生物細(xì)胞工廠實(shí)現(xiàn)高效生物合成成為突破生產(chǎn)限制的關(guān)鍵路徑。
發(fā)表于《Synthetic and Systems Biotechnology》的這項(xiàng)研究，通過整合生物信息學(xué)、深度學(xué)習(xí)引導(dǎo)的酶功能預(yù)測與多維度代謝工程改造，在模式真核微生物釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中構(gòu)建了完整的圣草枸櫞苷從頭合成途徑。研究團(tuán)隊(duì)首先采用深度學(xué)習(xí)平臺REME中的TurNuP模型，對30種植物來源的類黃酮-7-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（UF7GT）進(jìn)行催化常數(shù)（kcat）預(yù)測，篩選出茶樹（CsGT）和擬南芥（AtGT）來源的高效酶；進(jìn)而重構(gòu)UDP-鼠李糖合成途徑，構(gòu)建自給型RHM-NRS融合酶系統(tǒng)以減少輔因子依賴；通過過表達(dá)URA6、YNK1等基因增強(qiáng)UDP-葡萄糖供應(yīng)，并敲除ALG5、GLC3等競爭途徑基因，使圣草枸櫞苷產(chǎn)量從底物轉(zhuǎn)化階段的147.9 mg/L提升至從頭合成的30.5 mg/L。
關(guān)鍵技術(shù)方法包括：基于深度學(xué)習(xí)的酶活性預(yù)測、CRISPR/Cas9介導(dǎo)的多基因編輯、啟動子工程調(diào)控蛋白表達(dá)比例、糖苷水解酶基因敲除防止產(chǎn)物降解，以及HPLC定量分析代謝物。
3.1. 深度學(xué)習(xí)驅(qū)動的UF7GT發(fā)現(xiàn)與表征
通過整合生物信息學(xué)分析與TurNuP圖神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，從30種UF7GT中預(yù)測kcat值并分層驗(yàn)證，最終鑒定出CsGT和AtGT為催化效率最高的酶，其重組菌株ZY05和ZY02分別合成179.2 mg/L和161.2 mg/L的圣草枸櫞苷-7-O-葡萄糖苷。
3.2. UDP-鼠李糖代謝重構(gòu)促進(jìn)圣草枸櫞苷合成
引入植物來源的UDP-鼠李糖合酶（RHM）并與擬南芥NRS/ER結(jié)構(gòu)域融合，構(gòu)建自給型RHM-NRS系統(tǒng)，優(yōu)化輔因子循環(huán)。組合篩選顯示AtGT、OlRHM-NRS和克里曼丁橘（Cc1,6-RhaT）為最佳酶組合，菌株ZY18產(chǎn)量達(dá)117.5 mg/L。
3.3. 工程化UDP-葡萄糖供應(yīng)提升圣草枸櫞苷產(chǎn)量
過表達(dá)URA6（尿苷酸激酶）和YNK1（核苷二磷酸激酶）顯著增強(qiáng)UDP-葡萄糖合成，同時敲除ALG5（N-糖基化關(guān)鍵酶）和GLC3（糖原分支酶）減少代謝分流，使產(chǎn)量提升至147.9 mg/L。
3.4. 從頭合成圣草次苷的工程菌構(gòu)建
篩選Tricyrtis hirta來源F3′H與擬南芥CPR（AtCPR）為最優(yōu)P450系統(tǒng)，通過強(qiáng)啟動子TDH1p調(diào)控CPR表達(dá)比例，結(jié)合多拷貝質(zhì)粒與基因組整合，使圣草次苷產(chǎn)量達(dá)237.8 mg/L。
3.5. 圣草枸櫞苷從頭合成途徑整合
在敲除EXG1、SPR1、EGH1糖苷水解酶的底盤菌中引入優(yōu)化糖基化模塊，實(shí)現(xiàn)圣草枸櫞苷、圣草次苷-7-O-葡萄糖苷及副產(chǎn)物奈里托林（narirutin）的同步合成，最終通過協(xié)調(diào)UDP-葡萄糖供應(yīng)與競爭途徑阻斷，使目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量提升至30.5 mg/L。
該研究首次在釀酒酵母中建立了圣草枸櫞苷的從頭合成路線，突破了傳統(tǒng)生產(chǎn)中酶特異性低、糖苷供體不足及代謝競爭等瓶頸。通過深度學(xué)習(xí)輔助酶挖掘、合成途徑模塊化優(yōu)化及細(xì)胞工廠系統(tǒng)改造，為復(fù)雜天然產(chǎn)物的微生物智造提供了可擴(kuò)展的技術(shù)框架，尤其為水溶性黃酮苷的綠色生物制造奠定了理論基礎(chǔ)與工程實(shí)踐范例。未來通過酶工程減少副產(chǎn)物奈里托林生成，將進(jìn)一步推動圣草枸櫞苷的工業(yè)化應(yīng)用。
