《Biosensors and Bioelectronics》：CRISPR-Initiated Exponential Amplification on Fluorescently-Barcoded Microspheres for Deep Learning-Assisted Multiplexed HPV Detection
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CRISPR-Cas9結合量子點編碼微珠和深度學習算法實現HPV16、HPV18、HPV33的高靈敏度多重檢測，檢測限低至0.2 pM，通過引物裂解和指數擴增簡化流程，適用于資源有限的地區近患者檢測。
白婷婷|曲曉軍|潘金順|唐玉珍|王盧海|周平|胡振珍|郭志瑞|朱葉飛|張宇
南京醫科大學第二附屬醫院實驗室醫學中心，中國南京210011
摘要
快速、低成本且多重的核酸檢測對人類健康至關重要，但仍然具有挑戰性。盡管CRISPR-Cas系統具有高特異性，但將其整合到適用于近患者檢測的多重檢測平臺中的程度仍然有限。在這里，我們介紹了一種生物傳感平臺，該平臺結合了CRISPR誘導的酶促擴增、量子點編碼的微珠和基于深度學習的圖像分析，用于多重檢測人乳頭瘤病毒（HPV）DNA。CRISPR/Cas9的高特異性首先觸發指數級擴增，然后產物被特異性地捕獲在微珠表面進行局部熒光讀取。一種定制的深度學習算法自動量化微珠的熒光，實現了穩健和自動化的分析。這種集成方法能夠同時檢測HPV16、HPV18和HPV33，檢測限低至0.2 pM。通過使用識別觸發的擴增和簡單的深度學習輔助熒光讀取，工作流程得到了顯著簡化。該平臺為分子診斷建立了一種通用且實用的戰略，顯示出在近患者檢測中的強大潛力。
引言
核酸檢測已成為現代醫學診斷中的基礎技術，在全球健康安全、疾病監測和臨床管理中發揮著越來越重要的作用。近期全球健康危機凸顯了對快速、經濟高效且多重病原體檢測方法的需求。（Kaminski等人，2021年；van Dongen等人，2020年；Wang等人，2020年）對于呼吸道感染，區分SARS-CoV-2、流感病毒等對于適當的臨床管理和感染控制非常有幫助（Bian等人，2024年；Patchsung等人，2020年；Xiong等人，2021年；Ye等人，2025年）。同樣，準確識別和亞型分類人乳頭瘤病毒（HPV）對于癌癥風險分層和預防干預也至關重要（Xu等人，2022年）。世界衛生組織發起的宮頸癌消除計劃進一步強調了在高發病率和資源匱乏環境中進行可及、準確的多重HPV檢測的迫切需求。（組織，2022年）
自聚合酶鏈反應（PCR）技術最初開發以來，核酸檢測領域發生了巨大變化。（Schmittgen和Livak，2008年）到目前為止，下一代測序（NGS）代表了全面病原體檢測的當前金標準，能夠從臨床樣本中識別已知和新的病原體。（Gu等人，2021年）然而，由于需要昂貴的設備、復雜的操作、緩慢的結果和高成本，這些方法在常規診斷測試中受到了嚴重限制。為了解決這些限制，出現了等溫擴增技術，如環介導的等溫擴增（LAMP）、重組酶聚合酶擴增（RPA）、鏈置換擴增（SDA）和解旋酶依賴性擴增（HDA）（Wei等人，2022年）。選擇這些方法時必須權衡靈敏度、特異性、簡單性和成本之間的平衡。
CRISPR-Cas系統（規律間隔短回文重復序列和CRISPR相關蛋白）似乎是滿足高靈敏度核苷酸檢測需求的理想選擇。CRISPR效應子包括Cas9、Cas12a和Cas13a/b，已與各種檢測模塊結合，形成了基于CRISPR的核酸診斷技術，因為它們具有高特異性。（Liu等人，2025年；Tang等人，2021年）盡管取得了這些進展，但在實現穩健的多重檢測能力方面仍存在挑戰。首先，為了克服基于PCR方法的局限性，引入了RPA作為預擴增過程，使得在低至1 aM的濃度下也能檢測到DNA底物（Feng等人，2025年；Wang等人，2020年）。這些預擴增方法依賴于多種酶、特殊試劑和復雜的引物設計，定義了檢測靈敏度和特異性的限制，從而阻礙了CRISPR獨特識別特異性的有效利用（Wang等人，2019年）。最近的創新嘗試通過使用發夾探針激活Cas12來避免預擴增，這代表了在保持高靈敏度的同時簡化檢測架構的一個獨特方向（Chen等人，2025年；Lim等人，2025年；Moon等人，2025年）。其次，大多數當前的基于CRISPR的檢測平臺雖然能夠檢測單一目標，但缺乏進行穩健的多目標檢測的能力。這些平臺主要依賴于Cas酶的附帶切割活性，這使得在單個管中難以區分多個目標。為了克服這一限制，像SHERLOCKv2這樣的策略利用了具有不同報告特異性的多個Cas酶，這增加了復雜性并引發了潛在交叉反應的擔憂（Gootenberg等人，2018年；Kellner等人，2019年）。在多重檢測方面的挑戰在HPV檢測中尤為明顯，因為HPV有超過100種不同的亞型，至少有14種已知的高風險類型（組織，2022年；Xu等人，2022年）。目前在臨床實踐中，診斷重點主要放在HPV16和HPV18上，這兩種類型占全球宮頸癌病例的約70%。因此，迫切需要開發一種簡單且全面的HPV多重檢測方法，以實現經濟高效的大規模篩查。
最近的創新主要集中在整合多種技術以克服這些限制。等溫后擴增步驟與CRISPR介導的檢測相結合，在檢測低豐度目標方面顯示出高靈敏度（Kaminski等人，2021年）。同樣，通過熒光微球、光子晶體或在微流控設備中的空間編碼，引入條形碼策略為實現真正的多重檢測提供了有希望的途徑（Xu等人，2022年；Zhang等人，2021年；Zhang等人，2025年）。特別是基于量子點的條形碼方法由于其狹窄的發射光譜和光穩定性而在多重檢測中具有明顯優勢（Guo等人，2017年）
在這項工作中，我們提出了一種名為CRISPR-誘導指數擴增在條形碼微球（CRISPR-EAB）上的多重HPV檢測集成生物傳感平臺。它結合了CRISPR-Cas9識別與等溫指數擴增（iEXPAR），隨后在量子點條形碼聚苯乙烯微球（Qbeads）上進行分支雜交鏈反應（B-HCR）。這允許在同一管中同時檢測HPV16、HPV18和HPV33。基于StarDist神經網絡的深度學習輔助圖像分析模塊自動化了Qbeads的分割和熒光量化。該平臺將精確識別、高效擴增、多重檢測和智能分析集成到一個簡化的 workflow 中，為資源匱乏地區的簡單多重HPV檢測提供了強大的工具。
實驗試劑和材料
實驗中使用了以下試劑：10 μm大小的羧基化聚苯乙烯微球（PS微球，ZHONGKELEIMING，中國）；藍光發射的ZnCds/ZnS量子點（發射波長：450 nm）和綠光發射的CdSe/ZnS量子點（發射波長：520 nm）（Xingzi，中國）；四乙基正硅酸鹽（TEOS，99.999%），氨（NH3·H2O，28 wt%），(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷（APS，97%），琥珀酸酐（99%），N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亞胺鹽酸鹽晶體（EDC），N-羥基磺基琥珀酰亞胺鈉
多重HPV檢測平臺原理
多重HPV檢測平臺的原理如圖1所示。該過程從可編程的目標HPV雙鏈DNA的解旋和切割開始。首先，sgRNA與Cas9結合，形成CRISPR RNP復合物。在sgRNA的引導下，RNP復合物定位并結合到互補的雙鏈DNA目標上，激活Cas9的切割活性。切割精確發生在PAM位點上游的第三個和第四個核苷酸之間的磷酸二酯鍵處
結論
總之，我們開發了一個穩健的、通用的近患者檢測平臺，該平臺將CRISPR-Cas系統與Qbeads和DL輔助成像模塊相結合，實現了無需復雜實驗室基礎設施的多重HPV DNA檢測。該平臺基于市售的PS微球和量子點構建。量子點的多樣性和光穩定性熒光特性促進了多重條形碼的可擴展合成，而成熟的供應鏈確保了其
利益沖突聲明
作者聲明他們沒有已知的競爭性財務利益或個人關系可能影響本文報告的工作。
作者貢獻聲明
王盧海：驗證。
周平：數據管理。
潘金順：方法學、研究。
唐玉珍：數據管理。
白婷婷：撰寫——原始草稿、方法學、研究、資金獲取、概念化。
曲曉軍：方法學、研究。
張宇：資源、資金獲取、概念化。
朱葉飛：資源、方法學、資金獲取。
胡振珍：驗證。
郭志瑞：正式分析
利益沖突聲明
? 作者聲明他們沒有已知的競爭性財務利益或個人關系可能影響本文報告的工作。
致謝
本工作得到了江蘇省研發重點項目（BE2023785，BE2017763）、江蘇省衛生委員會醫學研究項目（M2021006）、國家自然科學基金（82172111）的財政支持，以及東南大學數字醫學工程國家重點實驗室開放研究基金（2023-M05）的支持。
