《Microchemical Journal》：Aptamer-based CRISPR/Cas12a system for amplification-free live pathogenic
Shigella flexneri detection
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CRISPR/Cas12a與aptamer結合無需核酸提取即可快速檢測活菌，靈敏度達225 CFU/mL，且能區(qū)分活死菌，優(yōu)于傳統qPCR方法。
Juan Geng|張安然|龍金兆|金月飛|陳帥胤|段光才
中國鄭州大學公共衛(wèi)生學院流行病學與健康統計系
摘要
志賀菌病是許多發(fā)展中國家面臨的嚴重公共衛(wèi)生問題。目前檢測志賀菌的金標準仍然是細菌培養(yǎng)，但這種方法步驟繁瑣且培養(yǎng)時間較長。CRISPR檢測系統在傳染病診斷中表現出優(yōu)異的性能。然而，傳統的基于CRISPR的檢測平臺雖然靈敏度高，但依賴于核酸提取和擴增，并且無法區(qū)分樣本中的活菌和死菌。本文將適配體的強結合特異性與CRISPR/Cas12a的強大信號放大能力相結合，建立了一種新型檢測方法，能夠高靈敏度、高特異性地檢測活的弗氏志賀菌（S. flexneri），無需進行核酸提取或擴增。實驗結果表明，CRISPR/Cas12a檢測系統的最佳條件為：Cas12a濃度為50 nM，反應緩沖液使用NEBuffer r2.1，Cas12a與crRNA的濃度比為1:1。此外，細菌與適配體阻斷劑雜交置換反應的最佳條件為Tris-HCl緩沖液（pH 8.0），室溫下孵育1小時。在上述條件下，基于適配體的CRISPR/Cas12a系統比qPCR方法具有更高的靈敏度和特異性，同時還能判斷細菌的存活狀態(tài)。該方法可在1.5小時內檢測到低至225 CFU/mL的活弗氏志賀菌�？傊狙芯块_發(fā)的活弗氏志賀菌檢測平臺為細菌性痢疾及其他細菌感染的監(jiān)測和控制提供了一種快速檢測技術。
引言
作為許多地區(qū)主要的志賀菌物種，弗氏志賀菌（S. flexneri）在全球范圍內廣泛分布，是高度傳染性腹瀉疾病的主要致病菌[1]、[2]、[3]。弗氏志賀菌對公共衛(wèi)生構成嚴重威脅。因此，臨床樣本中這種病原體的快速、靈敏檢測對于有效干預至關重要。目前金標準的檢測方法是細菌培養(yǎng)，但耗時較長，通常需要2-3天。傳統的病原菌檢測技術，如酶聯免疫吸附測定（ELISA）、聚合酶鏈反應（PCR）和定量實時PCR（qPCR），雖然具有檢測快速、靈敏度高和特異性好的優(yōu)點，但也存在以下缺點：（1）依賴昂貴的實驗室設備；（2）操作復雜，需要專業(yè)技術人員；（3）無法區(qū)分細菌的生死狀態(tài)。因此，開發(fā)簡便、低成本且高度靈敏的活菌檢測技術至關重要。
成簇規(guī)律間隔短回文重復序列（CRISPR）及其相關系統（Cas）不僅被用于基因組編輯，還應用于醫(yī)學核酸診斷等多個領域，已成為下一代分子檢測技術。代表性的平臺包括SHERLOCK（Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter Unlocking，使用Cas13a）和DETECTR（DNA Endonuclease-Targeted CRISPR Trans Reporter，使用Cas12a）進行核酸檢測。Cas效應蛋白在引導RNA的指導下能夠識別并破壞目標核酸。特別是Cas12a效應蛋白可以通過短的原間隔序列（PAM）識別并結合雙鏈DNA（dsDNA）及單鏈DNA（ssDNA）。這種結合會引發(fā)Cas12a的構象變化，激活其DNase活性，切割目標DNA并降解周圍的非目標單鏈DNA。因此，通過監(jiān)測Cas12a切割非特異性單鏈DNA報告探針產生的熒光信號來實現目標DNA的檢測。然而，傳統的CRISPR/Cas系統通過識別核酸來檢測細菌，因此其應用僅限于基于核酸的檢測方法，且仍依賴于提取和擴增步驟。因此，我們需要一種新的機制來實現核酸與非核酸之間的信號傳遞。
適配體是一種短的單鏈DNA或RNA分子，能高特異性地結合多種目標，包括小分子或蛋白質，通常通過指數富集（SELEX）技術系統篩選獲得[4]、[5]。適配體被稱為“化學抗體”，相比傳統抗體具有多種優(yōu)勢，如體積小、熱穩(wěn)定性高、生產成本低、易于擴增和免疫原性低[6]、[7]。將適配體與強大的信號放大策略（尤其是CRISPR-Cas系統）結合，代表了分子診斷領域的重大突破。在這種配置中，適配體作為高特異性的目標捕獲器，結合后觸發(fā)構象變化或啟動下游反應，激活Cas酶的切割活性。這種協同作用利用了適配體的精確靶向能力和CRISPR的強大切割能力，從而實現極高的靈敏度和特異性，為復雜臨床樣本中病原體和低豐度生物標志物的早期檢測開辟了新途徑。
本文旨在結合適配體生物傳感器的優(yōu)勢和CRISPR/Cas12a的切割活性，開發(fā)一種無需核酸提取的活弗氏志賀菌檢測方法。該檢測系統如圖1所示，包含兩個關鍵組件：一種特異性捕獲弗氏志賀菌細胞的適配體，以及一種用于調節(jié)CRISPR/Cas12a系統活性的阻斷鏈。當適配體與活弗氏志賀菌結合時，會觸發(fā)阻斷鏈從雜交雙鏈DNA（Hy-dsDNA）中釋放，釋放的阻斷鏈激活Cas12a/crRNA復合物，使其切割熒光淬滅劑（FQ）標記的單鏈DNA報告探針，產生可測量的熒光信號[8]。該系統無需核酸提取和擴增，克服了傳統CRISPR檢測方法的局限性，顯著擴展了其在活細胞檢測和分析中的應用范圍。
試劑與材料
本研究中使用的弗氏志賀菌（ATCC 12022）、大腸桿菌（E. coli ATCC 25922）、宋內志賀菌（S. sonnei）、肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）和金黃色葡萄球菌（S. aureus）均為實驗室保存的菌株。所有寡核苷酸由中國北京BGI基因組公司合成。HiScribe? T7快速高產量RNA合成試劑盒（NEB #E2050S）、Engen Lba Cas12a和NEBuffer?（r1.1、r2.1、r3.1、rCutsmart）購自美國馬薩諸塞州Ipswich的新英格蘭生物實驗室（New England Biolabs）。
高效穩(wěn)定阻斷劑的篩選
本研究中使用的適配體、阻斷劑和crRNA的序列見表S1。瓊脂糖凝膠電泳結果顯示適配體與阻斷劑形成了雜交鏈，如圖2A所示。此外，通過將Cy5熒光團和BHQ2淬滅劑分別連接到阻斷劑和適配體的末端進行熒光標記，如圖2B和C所示，Blocker5顯示出最高的熒光強度
細菌檢測方法
傳統的細菌檢測方法（如培養(yǎng)和生化鑒定）雖然準確性和存活率評估能力強，但操作繁瑣且耗時[12]、[13]、[14]。近年來，為了開發(fā)快速、現場可用的病原菌檢測工具，多種分子方法應運而生[15]。基于核酸的技術（以定量PCR（qPCR）為代表）已在分子生物學領域得到廣泛應用結論
本研究開發(fā)了一種基于Cas12a-適配體的生物傳感器，無需擴增即可直接檢測活病原體，利用適配體的特異性結合和CRISPR的程序化激活機制。該檢測方法對弗氏志賀菌的檢測靈敏度和特異性很高，檢出限為225 CFU/mL。此外，該方法相比其他基于CRISPR的適配體平臺具有顯著優(yōu)勢，能夠區(qū)分活菌和死菌。
CRediT作者貢獻聲明
Juan Geng：撰寫 – 審稿與編輯、初稿撰寫、數據整理、概念設計。張安然：初稿撰寫、數據分析、數據整理。龍金兆：審稿與編輯。金月飛：審稿與編輯。陳帥胤：審稿與編輯、監(jiān)督、資源協調、項目管理、資金申請。段光才：監(jiān)督、資源協調。
利益沖突聲明
作者聲明沒有已知的可能影響本文研究的財務利益或個人關系。
資助
本研究得到了國家自然科學基金（編號82073618）的支持。
