植物病害繼續(xù)對全球糧食生產(chǎn)構(gòu)成嚴重且持續(xù)的威脅。在主要種植系統(tǒng)中，病毒、細菌、真菌、線蟲和卵菌等病原體每年導(dǎo)致20-40%的產(chǎn)量損失，經(jīng)濟損失達數(shù)百億美元（CABI, 2025; FAO, 2025; Savary等人, 2019）。這些損失不僅削弱了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)能力，還危及糧食安全、農(nóng)村生計和國際貿(mào)易。氣候變化導(dǎo)致的病原體流行趨勢、植物材料全球流動以及高致病性病原體的快速進化進一步加劇了風(fēng)險，迫切需要早期、準確的病害檢測（Chaloner等人, 2021）。
及時識別植物病原體是有效管理病害、根除病害和實施檢疫的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的診斷方法如聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、定量PCR（qPCR）、酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）和環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）長期以來一直是植物病原體檢測的核心。雖然這些實驗室技術(shù)具有高分析靈敏度和特異性，但在非控制環(huán)境下使用時存在諸多實際限制。PCR和qPCR需要熱循環(huán)儀、不間斷電源和受過培訓(xùn)的人員，因此不適合快速田間應(yīng)用（Mumford等人, 2016）。ELISA雖然簡單且成本低廉，但通常缺乏早期檢測低滴度感染所需的靈敏度（Ward等人, 2004）。LAMP提供了更便攜的等溫擴增方式，但其復(fù)雜的引物設(shè)計和偶爾出現(xiàn)的假陽性反應(yīng)限制了其在多變田間條件下的可靠性（Notomi等人, 2015）。
近年來，CRISPR-Cas系統(tǒng)作為分子診斷的多功能平臺嶄露頭角，利用其天然的序列特異性核酸識別能力。第二類CRISPR效應(yīng)子如Cas12a、Cas12b、Cas13a和較小的Cas蛋白（例如Cas12f/Cas14）具有獨特的生化特性，可實現(xiàn)對DNA或RNA目標的快速敏感檢測。Cas12型酶在結(jié)合目標后能識別DNA序列并觸發(fā)附近單鏈DNA的報告基因的切割，產(chǎn)生可見信號（Chen等人, 2018）。類似地，Cas13酶能識別RNA并激活強效的RNase活性，通過熒光或側(cè)向流動檢測方法檢測植物RNA病毒（Gootenberg等人, 2017）。微型Cas變體（如Cas12f和Cas14）體積小巧、PAM（保護性寡核苷酸）要求簡單，且適應(yīng)資源匱乏的環(huán)境，使其成為便攜式診斷設(shè)備的理想候選者（Harrington等人, 2018）。
這些特性推動了新一代基于CRISPR的診斷平臺的發(fā)展，包括DETECTR（Cas12a）、SHERLOCK（Cas13a）、HOLMES（Cas12a）和FELUDA（FnCas9），這些平臺已成功應(yīng)用于人類、獸醫(yī)和環(huán)境檢測領(lǐng)域。植物病理學(xué)也從中受益：最新研究表明，基于Cas13a的檢測方法可用于早期檢測植物RNA病毒（Karimi等人, 2025），基于Cas12a的工作流程可用于檢測如Alternaria等真菌病原體（Shaizadinova等人, 2025），以及集成智能手機的RPA-Cas12a系統(tǒng)用于檢測Phytophthora infestans（Zhao等人, 2025）。這些發(fā)現(xiàn)凸顯了CRISPR診斷技術(shù)在克服傳統(tǒng)工具局限性方面的潛力，提供了快速、等溫、用戶友好的檢測方法，適用于現(xiàn)場使用。
盡管取得了這些進展，但仍存在一個主要障礙：針對植物病原體的CRISPR-Cas診斷方法很少以完整的、可復(fù)制的方案形式呈現(xiàn)。大多數(shù)已發(fā)表的研究僅展示了概念驗證，但常省略了關(guān)鍵的操作細節(jié)，如適用于田間的樣品提取、試劑穩(wěn)定性、孵育條件、側(cè)向流動結(jié)果的解讀、故障排除和質(zhì)量控制步驟，而這些步驟對于植物健康專業(yè)人員的實際應(yīng)用至關(guān)重要。正如該領(lǐng)域的研究人員所指出的，缺乏可實施的方案限制了CRISPR檢測方法從實驗室原型向真正用于植物病害監(jiān)測、檢疫篩查和快速田間診斷工具的轉(zhuǎn)化。
為解決這一差距，本文提供了標準化、適用于田間的CRISPR-Cas診斷工作流程，專為資源有限和現(xiàn)場條件設(shè)計。我們開發(fā)了三種可實施的檢測方案：
1.用于DNA病原體（如細菌和真菌）的RPA-Cas12a側(cè)向流動檢測方法，
2.用于RNA病毒的快速Cas13a RT-RPA檢測方法，以及
3.適用于便攜式或移動實驗室的無擴增Cas12a電化學(xué)生物傳感器。
每種工作流程都配有詳細的步驟指南、試劑配方、孵育條件、樣品制備方法、故障排除指南、試劑穩(wěn)定策略以及集成選項（如基于智能手機的讀數(shù)）。通過將基于CRISPR的檢測方法從概念驗證轉(zhuǎn)化為實際操作方法，本文旨在加速診斷實驗室、推廣網(wǎng)絡(luò)、植物檢疫檢查員和從事植物病害監(jiān)測的研究團隊的采用。
