《Postharvest Biology and Technology》：SlCNR promotes the lycopene accumulation and reduces abscisic acid content in postharvest tomato fruit
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番茄SlCNR轉錄因子調控后收獲成熟中番茄紅素環化與ABA代謝的分子機制研究。使用CRISPR/Cas9創制SlCNR敲除和過表達植株，發現KO SlCNR番茄紅素含量降低50-70%，ABA水平升高，乙烯合成減少且外源乙烯無法逆轉番茄紅素積累。分子機制表明SlCNR直接抑制LCY-E和LCY-B基因，激活CYP707A2基因，從而調控番茄紅素合成與ABA代謝平衡，延緩成熟進程。
張帥|孟明哲|陳迪|馬立群|張世元|胡婷婷|于琳|曹建康|傅大琦|朱本忠|朱洪亮|曲貴勤
中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京100083
摘要
番茄紅素環化和脫落酸（ABA）的代謝對果實采后成熟和顏色發展起著重要作用；然而，這些過程受果實相關轉錄因子（TFs）的轉錄調控機制尚不明確。本研究利用CRISPR/Cas9技術構建了敲除和過表達番茄品系，以探究Colorless non-ripening（SlCNR）基因在果實采后成熟中的作用。SlCNR屬于SBP/SPL家族轉錄因子，在番茄果實中高表達。果實成熟時呈綠色，然后在室溫下儲存16天，期間每隔4天監測一次與成熟相關的品質指標，包括硬度、總可溶性固形物、番茄紅素含量、總黃酮含量和重量損失。與野生型（WT）果實相比，敲除SlCNR的果實b*值增加，番茄紅素含量減少50–70%，ABA水平升高；而過表達SlCNR的果實則表現出相反的趨勢。敲除SlCNR的果實采后產生的乙烯較少，外源乙烯處理也無法使番茄紅素含量恢復到野生型水平。轉錄組學和qRT-PCR分析顯示，SlCNR轉基因果實中的番茄紅素環化基因和ABA代謝基因發生了顯著的變化。此外，電泳遷移率和雙熒光素酶報告基因實驗表明，SlCNR直接抑制番茄紅素環化基因SlLCY-E和SlCYC-B以及ABA合成基因SlNCED1的表達，同時激活ABA降解基因SlCYP707A2的表達，從而促進番茄紅素的積累并減少ABA的合成。綜上所述，SlCNR是一個在果實采后成熟過程中整合番茄紅素環化和ABA代謝的轉錄調節因子。
引言
采后成熟技術被廣泛用于延長 climacteric 果實的保質期并便于儲存和運輸；因此，這些果實通常在成熟綠色期或 pre-climacteric 期收獲，并在常溫或受控條件下進行后熟（Al-Dairi 等，2023；Joas 等，2012；Maduwanthi 和 Marapana，2019；Zhang 等，2020）。然而，與在植株上成熟的果實相比，采后成熟會改變與成熟相關的代謝過程，導致質量相關代謝物（尤其是番茄紅素等色素）的積累不足（Arah 等，2015；Min 等，2022；Wang 等，2023a）。番茄果實是研究采后成熟的模式生物，已通過大規模轉錄組學、代謝組學和表觀基因組學方法鑒定出與成熟過程和顏色發展相關的基因和途徑（Bai 等，2023；Giovannoni，2004；Zhou 等，2024a）。盡管這些研究提供了有價值的信息，但大多數研究依賴于未經過基因改造的果實或外源化學處理，限制了候選調控因子的功能驗證。特別是，果實特異性轉錄因子在采后成熟過程中的轉錄功能仍不明確。因此，需要利用穩定的轉基因果實進行功能分析，以闡明果實采后顏色發展和品質維持的調控機制。
番茄紅素是番茄中的主要抗氧化類胡蘿卜素，它是一種由異戊二烯前體在質體中合成的非環狀化合物，賦予成熟番茄紅色，并具有強效的抗氧化活性（Ballester 等，2010；Caseiro 等，2020）。番茄紅素的生物合成始于phytoene synthase（PSY）催化geranylgeranyl pyrophosphate（GGPP）縮合生成phytoene。隨后通過phytoene desaturase（PDS）和ζ-carotene desaturase（ZDS）進行去飽和反應，再通過15-cis ζ-carotene isomerase（ZISO）和carotenoid isomerase（CrtISO）進行異構化，最終生成all-trans番茄紅素（Liu 等，2015）。關鍵番茄紅素合成基因SlPSY1、SlPDS和SlZDS的表達與番茄紅素含量呈正相關（Fantini 等，2013）。番茄和柑橘中的PSY1和PDS基因受到SIBBX20、SIHY5、SlRIN和CsMADS3等多種轉錄因子的調控（Li 等，2018；Wang 等，2021；Xiong 等，2019；Zhu 等，2023）。
植物中番茄紅素的積累反映了其從頭合成與環化之間的精細平衡。番茄紅素的環化通過兩條途徑實現：一條由番茄紅素β-環化酶（LCY-B）催化生成β-胡蘿卜素，另一條由番茄紅素ε-環化酶（LCY-E）催化生成α-胡蘿卜素（Liu 等，2015）。LCY-B和LCY-E基因在柑橘、木瓜和番茄物種中均有表達，并與番茄紅素含量呈負相關（Alquézar 等，2009；Devitt 等，2010；Wu 等，2022）。質體特異性的番茄紅素β-環化基因SlCYC-B在番茄果實中表達（Ronen 等，2000）。與野生型相比，敲除SlCYC-B可增加番茄果實成熟初期和紅色階段的番茄紅素積累（Arruabarrena 等，2023），而過表達SlLCY-E可增加α-胡蘿卜素和葉黃素的合成，同時降低番茄紅素含量（Wu 等，2022）。
此外，環化的類胡蘿卜素中間體（如β-胡蘿卜素）是脫落酸（ABA）合成的前體，9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase（NCED）和ABA aldehyde oxidase（AO）是驅動ABA形成的關鍵酶，而ABA的降解主要由ABA 8’-hydroxylase（CYP707A）調節（Liu 等，2015；Wu 等，2023）。直接調控ABA合成酶可以調節ABA的積累，并對上游的番茄紅素代謝產生反饋控制。在番茄中抑制SlNCED1的表達可降低果實ABA含量并同時增加番茄紅素積累（Sun 等，2012）。然而，果實中與成熟相關的轉錄因子在番茄紅素環化和ABA代謝途徑中的直接調控作用尚未完全闡明。
SBP/SPL轉錄因子家族成員在多種物種中被廣泛記錄，可調節多種生物過程，包括果實發育或成熟、應激反應以及開花時間的協調（Jung 等，2016；Ma 等，2021；Sun 等，2023）。SlCNR是SBP/SPL轉錄因子家族的成員，在番茄果實中高表達（Manning 等，2006）。CRISPR/Cas9技術敲除SlCNR顯著增強了番茄果實成熟過程中的黃酮積累并減少了水分損失（Chen 等，2024；Zhou 等，2024b）。然而，SlCNR在果實采后品質（尤其是調控番茄紅素積累）中的調控作用仍需進一步研究。通過使用CRISPR/Cas9編輯和過表達番茄品系，我們發現SlCNR通過直接調控類胡蘿卜素環化和ABA代謝相關基因來調節番茄紅素和ABA的積累。此外，抑制SlCNR的表達可延長番茄的保質期并維持可溶性糖的水平。這些發現擴展了SlCNR在果實采后成熟中的功能作用，并加深了我們對SBP/SPL轉錄因子在調節果實品質方面的理解。
植物材料
所用植物材料基于野生型番茄（Solanum lycopersicum cv. Ailsa Craig）的遺傳背景。SlCNR敲除和過表達品系由我們實驗室制備（Chen 等，2024；Gao 等，2019）。詳細信息見補充方法部分。在之前的研究中，我們使用特異性抗SlCNR多克隆抗體進行了Western blot分析，證實敲除品系中不存在SlCNR蛋白。
SlCNR促進采后番茄果實的成熟過程
為了評估SlCNR是否調控采后成熟，我們在成熟綠色期收獲了野生型（WT）、SlCNR敲除突變體和SlCNR過表達品系的果實，并在25±1°C和80±5%相對濕度下儲存16天。如圖1A所示，敲除SlCNR的果實采后成熟過程受到抑制，尤其是SlCNR#23品系的表現更為明顯。相比之下，過表達SlCNR的果實加速了采后成熟過程。
討論
番茄紅素環化和ABA代謝的調控是控制果實顏色發展的復雜網絡中的關鍵節點（Graves 等，2026；Hong 等，2019）。越來越多的證據表明，番茄紅素環化基因（如SlCYC-B（Arruabarrena 等，2023）、SlLCYB2（Na 等，2025）、DkLCYb（Qi 等，2021）和SlLCYE（Wu 等，2022）是調控果實番茄紅素含量的關鍵因子。此外，脫落酸（ABA）及其相關的合成和降解基因也起著重要作用。
結論
總之，SlCNR通過協調番茄紅素環化和ABA代謝來調控番茄果實的采后成熟。SlCNR直接抑制番茄紅素環化基因SlLCY-E和SlCYC-B的表達，從而影響番茄紅素的積累，并通過調控SlNCED1和SlCYP707A2來調節ABA的平衡。通過這些調控作用，SlCNR促進了果實采后的顏色發展、成熟進程等。
CRediT作者貢獻聲明
張帥：撰寫——原始草稿、方法學、實驗設計。曲貴勤：撰寫——審稿與編輯、監督、項目管理、實驗設計、資金獲取、概念構思。馬立群：撰寫——審稿與編輯、方法學。陳迪：方法學。孟明哲：撰寫——審稿與編輯、方法學。曹建康：方法學、資金獲取。于琳：方法學。胡婷婷：方法學。張世元：方法學。朱洪亮：方法學、資金獲取。
利益沖突聲明
作者聲明沒有已知的財務利益或個人關系可能影響本文的研究結果。
致謝
本研究得到了國家重點研發計劃（2022YFD2100101）和國家自然科學基金（31972128）的支持。
