《Synthetic and Systems Biotechnology》：Engineering of multiple modules to enhance lignocellulose degradation ability in
Bacillus subtilis using CRISPR/Cas9 system
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本研究針對(duì)野生型枯草芽孢桿菌纖維素酶系統(tǒng)不完整、活性低的問(wèn)題，通過(guò)CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯，優(yōu)化信號(hào)肽、轉(zhuǎn)錄終止子和染色體整合位點(diǎn)，構(gòu)建了能高效分泌內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶三重纖維素酶系統(tǒng)的工程菌株BSK3P2C。該菌株在小麥秸稈發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中顯著降低半纖維素（16.70%）、中性洗滌纖維（7.46%）和酸性洗滌纖維（9.93%）含量，為木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的高效轉(zhuǎn)化提供了新策略。
隨著全球?qū)稍偕茉葱枨蟮娜找嬖鲩L(zhǎng)，木質(zhì)纖維素生物質(zhì)作為最豐富的可再生資源之一，其高效轉(zhuǎn)化技術(shù)成為研究熱點(diǎn)。這類(lèi)生物質(zhì)主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素構(gòu)成，其中纖維素降解是制約其利用效率的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。盡管自然界中許多微生物能夠產(chǎn)生纖維素酶，但野生型菌株通常存在酶活性低、纖維素酶系統(tǒng)不完整等問(wèn)題，限制了其工業(yè)化應(yīng)用。
枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）作為一種公認(rèn)安全的革蘭氏陽(yáng)性菌，具有非致病性、高蛋白分泌能力和易于遺傳操作等優(yōu)點(diǎn)，已成為工業(yè)用重組蛋白生產(chǎn)的理想底盤(pán)菌。然而，野生型枯草芽孢桿菌168僅具備內(nèi)切葡聚糖酶活性，缺乏外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶活性，導(dǎo)致其纖維素降解能力有限。近年來(lái)，CRISPR基因編輯技術(shù)的發(fā)展為微生物遺傳改造提供了強(qiáng)大工具，但利用該技術(shù)構(gòu)建具有完整纖維素酶系統(tǒng)的枯草芽孢桿菌工程菌株的研究尚不多見(jiàn)。
為解決這一難題，西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院的研究團(tuán)隊(duì)在《Synthetic and Systems Biotechnology》上發(fā)表了一項(xiàng)創(chuàng)新性研究。他們通過(guò)CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)枯草芽孢桿菌進(jìn)行多模塊代謝工程改造，成功構(gòu)建了能夠高效降解木質(zhì)纖維素的重組菌株。
研究采用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)，通過(guò)優(yōu)化信號(hào)肽（包括Sec途徑的bglC、phoB和Tat途徑的phoD、lipA、ywbN）、轉(zhuǎn)錄終止子（TB4、TB5、TB9、TH1）和染色體整合位點(diǎn)（sprE、lacZ、thrC、nprE），將來(lái)自枯草芽孢桿菌RLI2019的內(nèi)切葡聚糖酶基因G2006和來(lái)自激烈熱球菌（Pyrococcus furiosus）的雙功能纖維素酶基因Bf1（同時(shí)具有外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶活性）導(dǎo)入枯草芽孢桿菌168基因組。研究人員構(gòu)建了多種重組菌株，并通過(guò)酶活性測(cè)定、生長(zhǎng)曲線(xiàn)分析和小麥秸稈發(fā)酵實(shí)驗(yàn)評(píng)估其降解性能。
3.1. 單一位點(diǎn)內(nèi)切葡聚糖酶的表達(dá)與優(yōu)化
研究首先將G2006表達(dá)盒整合到eglS位點(diǎn)，獲得菌株BSKI2006，其內(nèi)切葡聚糖酶活性比野生型提高59.18%。通過(guò)比較不同信號(hào)肽，發(fā)現(xiàn)bglC信號(hào)肽效果最佳，菌株BSsprP43BglC2006酶活性提高6.82倍。在篩選整合位點(diǎn)時(shí)，sprE位點(diǎn)表達(dá)效率最高，酶活性達(dá)112.56 U/mL。進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)現(xiàn)TB4終止子和P12啟動(dòng)子組合效果最優(yōu)，菌株BSsprP12BglC2006TB4酶活性達(dá)238.03 U/mL。
3.2. 兩個(gè)位點(diǎn)內(nèi)切葡聚糖酶的表達(dá)優(yōu)化
在BSsprP12BglC2006TB4基礎(chǔ)上，在lacZ位點(diǎn)整合帶有不同信號(hào)肽的G2006表達(dá)盒。結(jié)果顯示，同時(shí)使用Sec途徑信號(hào)肽bglC和Tat途徑信號(hào)肽lipA的菌株BSsprlacLip2006效果最顯著，內(nèi)切葡聚糖酶活性達(dá)268.89 U/mL，表明雙分泌途徑協(xié)同增強(qiáng)了蛋白分泌效率。
3.3. 單一位點(diǎn)雙功能纖維素酶的表達(dá)與優(yōu)化
研究人員將密碼子優(yōu)化的Bf1基因與不同信號(hào)肽組合表達(dá)。發(fā)現(xiàn)Tat途徑信號(hào)肽YwbN效果最佳，菌株BSthrP43YwbBfTH1的外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶活性分別達(dá)549.77 U/mL和349.26 U/mL。thrC位點(diǎn)整合效率最高，且基因組整合優(yōu)于質(zhì)粒表達(dá)。
3.4. 兩個(gè)位點(diǎn)雙功能纖維素酶的表達(dá)優(yōu)化
雙位點(diǎn)表達(dá)Bf1并未顯著提高酶活性，可能由于異源蛋白表達(dá)過(guò)載導(dǎo)致代謝負(fù)擔(dān)。這表明單個(gè)優(yōu)化位點(diǎn)已能滿(mǎn)足高效表達(dá)需求。
3.5. 復(fù)合纖維素酶的表達(dá)優(yōu)化
通過(guò)組合優(yōu)化，研究人員構(gòu)建了菌株BSKI3Cel（三個(gè)基因組整合表達(dá)盒）和BSK3P2C（額外添加質(zhì)粒pJOE2006Bf）。BSK3P2C在培養(yǎng)第8天時(shí)，三種纖維素酶活性分別達(dá)533.16、2959.83和2829.61 U/mL，表現(xiàn)出卓越的纖維素降解能力。
3.6. 重組菌株發(fā)酵對(duì)小麥秸稈理化特性的影響
發(fā)酵實(shí)驗(yàn)表明，BSK3P2C處理8天后，小麥秸稈的半纖維素、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量顯著降低，pH值升高，還原糖含量增加。掃描電鏡顯示秸稈表面結(jié)構(gòu)變得疏松多孔，傅里葉變換紅外光譜證實(shí)纖維素和半纖維素特征吸收峰減弱，說(shuō)明降解效果顯著。
該研究成功構(gòu)建了具有完整纖維素酶系統(tǒng)的枯草芽孢桿菌工程菌株，解決了野生菌纖維素降解能力不足的問(wèn)題。通過(guò)多參數(shù)系統(tǒng)優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了三種纖維素酶的高效協(xié)同表達(dá)。重組菌株在木質(zhì)纖維素降解方面表現(xiàn)出色，為生物質(zhì)能源開(kāi)發(fā)和農(nóng)業(yè)廢棄物利用提供了高效、安全的微生物平臺(tái)。這種基于CRISPR/Cas9的多模塊代謝工程策略，也為其他工業(yè)微生物的定向改造提供了重要參考。
