摘要

B型利鈉肽（BNP）是心血管疾病的重要生物標(biāo)志物，需要在復(fù)雜基質(zhì)中進(jìn)行敏感且穩(wěn)健的定量分析。本文報(bào)道了一種單電極、反相關(guān)的雙模式電化學(xué)發(fā)光/表面增強(qiáng)拉曼散射（ECL/SERS）生物傳感器，該傳感器將分裂適配體識(shí)別與溶液相T7轉(zhuǎn)錄-CRISPR/Cas13a級(jí)聯(lián)反應(yīng)以及界面位點(diǎn)介導(dǎo)的鏈位移“探針剝離”轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制結(jié)合在CsPbBr?@PDA@Au修飾的玻璃碳電極上。BNP結(jié)合后釋放活性T7模板，生成觸發(fā)RNA，激活Cas13a進(jìn)行旁路切割，產(chǎn)生用于界面解鎖的啟動(dòng)子鏈。界面反應(yīng)會(huì)去除鐵氰化物/拉曼共標(biāo)記的探針，使ECL信號(hào)與SERS信號(hào)同步開啟，從而實(shí)現(xiàn)比率定量（R = I_ECL/I_SERS），抑制共模變異。該傳感器能夠在0–10^6 aM的濃度范圍內(nèi)對(duì)BNP進(jìn)行檢測(cè)，具有對(duì)數(shù)線性校準(zhǔn)和連續(xù)的比率響應(yīng)。通過多種干擾物及結(jié)構(gòu)相關(guān)的肽NT-proBNP（同樣濃度為10^6 aM）的驗(yàn)證，顯示其比率變化可忽略不計(jì)。血清樣本評(píng)估和穩(wěn)定性測(cè)試進(jìn)一步證明了其在復(fù)雜基質(zhì)中的可行性。這項(xiàng)工作建立了一種級(jí)聯(lián)到界面的比率檢測(cè)策略，用于實(shí)現(xiàn)穩(wěn)健的蛋白質(zhì)生物傳感。

引言

B型利鈉肽（BNP）主要在心室肌擴(kuò)張和壓力負(fù)荷下釋放（Gong等人，2024；Wang等人，2023；Weber，2005）。循環(huán)中的BNP與NT-proBNP已成為心力衰竭診斷、風(fēng)險(xiǎn)分層和治療監(jiān)測(cè)的基石生物標(biāo)志物（Alcidi，2022；Cardarelli，2003）。更重要的是，BNP是一個(gè)動(dòng)態(tài)指標(biāo)：其水平上升反映了心室壁應(yīng)力的惡化，而干預(yù)后的下降則表明功能恢復(fù)和康復(fù)（de Lemos，2002）。因此，能夠在復(fù)雜生物流體中敏感可靠地定量BNP的分析工具不僅對(duì)早期診斷有用，也對(duì)治療效果和康復(fù)過程的縱向評(píng)估至關(guān)重要（Holditch，2015）。 傳統(tǒng)的BNP檢測(cè)方法（如ELISA和自動(dòng)化化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定）雖然提供了可靠的定量結(jié)果，但通常需要集中式實(shí)驗(yàn)室、多個(gè)洗滌步驟以及相對(duì)較大的樣本體積（Torma，2017）。這些工作流程和儀器限制了其在床旁檢測(cè)和持續(xù)監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用。此外，在血清中同時(shí)實(shí)現(xiàn)超高靈敏度和操作穩(wěn)健性仍然具有挑戰(zhàn)性，因?yàn)榉翘禺愋晕�附、光學(xué)漂移和基質(zhì)效應(yīng)可能會(huì)扭曲單通道讀數(shù)。這些實(shí)際限制推動(dòng)了可微型化的生物傳感器的發(fā)展，這些傳感器結(jié)合了強(qiáng)大的放大能力和自校準(zhǔn)、抗干擾的信號(hào)輸出（Samad，2023）。 CRISPR/Cas系統(tǒng)最近作為生物傳感的強(qiáng)大放大模塊而出現(xiàn)（Gong等人，2025；Li等人，2023a；Luo等人，2026；Tang等人，2024；Zhuo等人，2023）。特別是Cas13a是一種RNA引導(dǎo)的核糖核酸酶，一旦被特定RNA靶標(biāo)激活，會(huì)表現(xiàn)出強(qiáng)烈的旁路切割能力（Huang等人，2025a；Huang等人，2025b）。將Cas13a與T7 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄結(jié)合，可以實(shí)現(xiàn)等溫的“識(shí)別→轉(zhuǎn)錄→旁路切割”放大級(jí)聯(lián)反應(yīng)，將低豐度靶標(biāo)轉(zhuǎn)化為豐富的核酸觸發(fā)劑（Chen等人，2023；Dong等人，2023；Liu等人，2022）。然而，大多數(shù)基于CRISPR的生物傳感器仍然依賴于單一的光學(xué)或電化學(xué)通道，這使得它們?nèi)菀资艿江h(huán)境或電極間變異的影響。將CRISPR切割轉(zhuǎn)化為在固液界面上的穩(wěn)健定量信號(hào)，并實(shí)現(xiàn)比率自校正，仍然是一個(gè)重要目標(biāo)。 電化學(xué)發(fā)光（ECL）和表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS）是高度互補(bǔ)的轉(zhuǎn)導(dǎo)模式（Li等人，2023b；Li等人，2023c；Li等人，2023d；Liu等人，2023；Ma等人，2026）。ECL提供接近零的光學(xué)背景和由電化學(xué)勢(shì)驅(qū)動(dòng)的可控發(fā)射，而SERS則提供窄光譜特征和在等離子體熱點(diǎn)處的強(qiáng)增強(qiáng)效果。鉛鹵化物鈣鈦礦（如CsPbBr?）因其高亮度和有利的電荷轉(zhuǎn)移特性而成為有吸引力的ECL發(fā)光體，但其水溶性不穩(wěn)定限制了其直接用于生物傳感（Luo等人，2026；Ma等人，2026；Parihar等人，2022；Protesescu等人，2021）。多巴胺（PDA）可以形成保形粘合涂層，穩(wěn)定鈣鈦礦在水中的穩(wěn)定性，并提供用于進(jìn)一步功能化的兒茶酚/胺基團(tuán)。隨后的金納米粒子修飾在鈣鈦礦表面創(chuàng)建了大量熱點(diǎn)，使CsPbBr?@PDA@Au薄膜能夠作為緊湊的單電極雙模式ECL/SERS換能器。盡管有這些優(yōu)勢(shì)，但將T7–Cas13a放大級(jí)聯(lián)與基于鈣鈦礦的雙模式界面結(jié)合，以生成反相關(guān)的比率ECL/SERS信號(hào)用于蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物的研究仍很少。 盡管CRISPR-ECL生物傳感器取得了快速進(jìn)展，但大多數(shù)報(bào)道的平臺(tái)仍然依賴于單強(qiáng)度輸出進(jìn)行定量，這在實(shí)際測(cè)量中可能會(huì)受到共模變異的影響，例如電極間的換能器負(fù)載差異、微粗糙度、激發(fā)/收集效率的波動(dòng)以及基質(zhì)依賴的衰減或散射。雖然已經(jīng)探索了雙模式檢測(cè)方法以提供正交信息，但當(dāng)兩個(gè)通道不是內(nèi)在耦合到同一界面事件（或在不同基底上產(chǎn)生）時(shí)，第二個(gè)信號(hào)不一定能夠校正這些共模漂移。在這種情況下，從同一界面生成反相關(guān)輸出的單電極比率策略特別有價(jià)值，因?yàn)樗�能夠�(qū)崿F(xiàn)內(nèi)置的自歸一化，并提高不同電極和不同時(shí)間點(diǎn)的可比性——這對(duì)于臨床動(dòng)態(tài)生物標(biāo)志物的縱向監(jiān)測(cè)至關(guān)重要。 本文報(bào)道了一種單電極、反相關(guān)的雙模式ECL/SERS生物傳感器，通過將溶液相T7轉(zhuǎn)錄-CRISPR/Cas13a級(jí)聯(lián)與CsPbBr?@PDA@Au鈣鈦礦換能器結(jié)合在玻璃碳電極上實(shí)現(xiàn)BNP的檢測(cè)。重要的是，由于BNP是一種蛋白質(zhì)靶標(biāo)，無法直接激活Cas13a，因此需要一個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)和放大級(jí)聯(lián)過程，將結(jié)合事件轉(zhuǎn)化為RNA觸發(fā)劑，并在復(fù)雜基質(zhì)條件下將觸發(fā)劑的豐度提高到激活閾值以上。具體來說，BNP與分裂適配體結(jié)合后釋放活性T7模板，T7轉(zhuǎn)錄從單次識(shí)別事件生成多個(gè)觸發(fā)RNA副本，從而有效激活Cas13a；隨后的旁路切割將發(fā)夾狀底物轉(zhuǎn)化為啟動(dòng)子，驅(qū)動(dòng)電極界面處的位點(diǎn)介導(dǎo)的鏈位移反應(yīng)。這種界面位移“探針剝離”作用將鐵氰化物/拉曼染料共標(biāo)記的DNA納米探針從鈣鈦礦表面移除，同時(shí)釋放Fc淬滅劑以開啟ECL信號(hào)，并從金熱點(diǎn)處移除拉曼報(bào)告劑以關(guān)閉SERS信號(hào)，從而產(chǎn)生物理耦合的比率讀數(shù)（R = I_ECL/I_SERS）。通過這種界面耦合的比率設(shè)計(jì)，我們表征了CsPbBr?@PDA@Au納米復(fù)合材料，驗(yàn)證了逐步電極組裝和轉(zhuǎn)錄-Cas13a級(jí)聯(lián)的可行性，優(yōu)化了關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄/Cas13a參數(shù)，并展示了在寬工作范圍內(nèi)的超靈敏BNP檢測(cè)。選擇性、穩(wěn)定性和血清樣本評(píng)估進(jìn)一步證明了比率雙模式讀數(shù)在復(fù)雜基質(zhì)中的穩(wěn)健性，適用于可靠的BNP定量。

適配體/T7雙鏈、DNP探針和BNP標(biāo)準(zhǔn)品的制備

所有DNA/RNA儲(chǔ)備液均溶于無核酸酶的水中，濃度為100 μM。適配體和T7 Temp（均溶于1× T7緩沖液中，濃度為2.0 μM）通過加熱至90°C 5分鐘并以1°C/min的速度冷卻至25°C進(jìn)行退火處理，然后稀釋至100 nM。DNA通過將Fc鏈、4-MBA鏈和支架以1:1:1的比例（每種2.0 μM，溶于Tris–HCl 10 mM，pH 7.4，100 mM NaCl）混合制備，并采用相同的退火程序進(jìn)行退火，最后稀釋至0.50 μM。BNP儲(chǔ)備液（濃度為10.0 μg/mL）配制在含有0.1% BSA的PBS中；標(biāo)準(zhǔn)品通過連續(xù)稀釋獲得。

雙模式BNP生物傳感器的工作原理

首先構(gòu)建一個(gè)適配體-阻斷劑（Apt-B）雙鏈，通過將BNP適配體（Apt-A）與含有T7轉(zhuǎn)錄模板部分的適配體阻斷劑鏈雜交實(shí)現(xiàn)。在BNP存在下，目標(biāo)分子特異性結(jié)合到適配體上，引起構(gòu)象變化，使適配體阻斷劑從雙鏈中移除。釋放的阻斷劑鏈隨后與含有T7啟動(dòng)子序列的互補(bǔ)DNA雜交，形成完整的雙鏈DNA模板，用于T7 RNA的合成。

結(jié)論

本研究報(bào)道了一種單電極、反相關(guān)的雙模式ECL/SERS生物傳感平臺(tái)，用于BNP的檢測(cè)。該平臺(tái)將分裂適配體識(shí)別與溶液相T7轉(zhuǎn)錄-CRISPR/Cas13a級(jí)聯(lián)反應(yīng)以及界面鏈位移（“探針剝離”轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制結(jié)合在CsPbBr?@PDA@Au修飾的玻璃碳電極上。BNP結(jié)合后釋放活性T7模板，生成觸發(fā)RNA并激活Cas13a，后者程序性產(chǎn)生啟動(dòng)子鏈以解鎖表面探針。

CRediT作者貢獻(xiàn)聲明

楊莉：撰寫 – 審稿與編輯，撰寫 – 原稿，項(xiàng)目管理，方法學(xué)，數(shù)據(jù)分析，概念化。 任浩珍：驗(yàn)證，監(jiān)督，軟件，方法學(xué)，數(shù)據(jù)分析，概念化。 廖賢久：可視化，驗(yàn)證，監(jiān)督，軟件，資金獲取，數(shù)據(jù)分析，概念化。 黃龍建：驗(yàn)證，監(jiān)督，資源管理，項(xiàng)目管理，研究，資金獲取。 魏繼華：

未引用參考文獻(xiàn)

Alcidi等人，2022；Cardarelli和T，2003；Holditch等人，2015；Samad和Restini，2023；Torma等人，2017。

利益沖突

所有作者均聲明沒有可能影響本文工作的相關(guān)利益關(guān)系。

利益沖突聲明

作者聲明沒有已知的利益沖突或個(gè)人關(guān)系可能影響本文所述的工作。

致謝

我們衷心感謝以下機(jī)構(gòu)的財(cái)政支持： 國家自然科學(xué)基金（82260532）、 廣西自然科學(xué)基金（2025GXNSFHA069115）、 生命科學(xué)分析化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（SKLACLS2314）、 廣西骨科與關(guān)節(jié)退行性疾病基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（2022-220-06-202205）、 百色生物醫(yī)學(xué)分析化學(xué)與臨床分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（2022-38-05）。