《TrAC Trends in Analytical Chemistry》：Re-engineering Detection Paradigms: Atypical Reporters in CRISPR/Cas12a-Based Biosensing
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CRISPR/Cas12a系統的新型報告器研究進展，涵蓋工程線性DNA、特殊構象DNA、DNA-粒子共軛及DNA水凝膠等類型，分析其設計原理、工作機制及優勢特性，如超低檢測限、抗干擾能力提升、免標記信號轉換和多場景應用適配等，并探討現存挑戰與未來發展方向。
劉聰|黃玉杰|劉子龍|黃楚秀
華中科技大學法醫學系，中國湖北省武漢市香港路13號，430030
摘要
CRISPR/Cas12a系統已成為一種強大且前景廣闊的生物傳感平臺，在該平臺上，報告分子在決定檢測性能方面起著關鍵作用。雖然傳統的熒光團-淬滅劑標記的單鏈DNA（ssDNA）報告分子簡單且被廣泛采用，但它存在固有的局限性，包括靈敏度不足、對基質干擾的敏感性高以及信號輸出方式有限。近年來，人們精心設計了多種非傳統的報告分子，顯著提高了基于Cas12a的生物傳感器的性能。本綜述系統地總結了這些創新報告分子的最新進展，涵蓋了工程化線性DNA報告分子、特殊構型DNA報告分子、DNA-顆粒結合報告分子和DNA水凝膠報告分子。文章詳細闡述了它們的設計原理、工作機制以及出色的性能特點，如超低檢測限、增強的抗干擾能力、無標記信號轉導能力以及與即時檢測的兼容性。最后，本文進一步討論了關鍵挑戰和未來的發展方向，為下一代報告分子的開發提供了寶貴的參考。
引言
成簇規律間隔短回文重復序列（CRISPR）和CRISPR相關蛋白12a（Cas12a）系統已成為生物傳感領域的變革性工具。該系統的核心組成部分包括四種關鍵元素：Cas12a核酸酶、CRISPR RNA（crRNA）、目標核酸和報告分子（圖1）。crRNA作為分子引導劑，指導Cas12a特異性識別并切割互補的目標核酸。成功切割后，Cas12a酶發生構象變化，激活其非特異性切割活性，從而能夠無差別地降解單鏈DNA（ssDNA）。這一獨特特性為基于Cas12a的檢測平臺的發展奠定了基礎。研究人員設計了兩端修飾有熒光團（F）和淬滅劑（Q）的ssDNA作為“報告”分子。激活的Cas12a的切割行為使熒光團與淬滅劑分離，從而恢復可檢測的熒光。最初使用的經典ssDNA報告分子為F-TTATT-Q，是這種設計的先驅示例[1]。
作為基于Cas12a的生物傳感器中信號轉導的關鍵環節，報告分子的性能直接決定了傳感器的靈敏度、特異性及其在現實場景中的適應性。由于信號轉換的簡便性，經典的F-Q標記ssDNA報告分子被廣泛采用。然而，在實際應用中，尤其是在復雜基質或資源受限的環境中，這種傳統報告分子的固有局限性變得越來越明顯。這些缺點包括對未擴增樣本的靈敏度不足、對基質干擾的敏感性高、依賴昂貴的熒光標記以及信號輸出方式有限[2]、[3]。為了解決這些問題，人們開發了多種非傳統的報告分子，大大擴展了基于Cas12a的生物傳感器的應用范圍。這些創新報告分子包括工程化線性DNA[4]、[5]、[6]、[7]、[8]、[9]、特殊構型DNA[10]、[11]、[12]、DNA-顆粒結合結構[13]、[14]、[15]和DNA水凝膠[16]。這些非傳統報告分子在特定方面表現出優異的性能，如超高靈敏度、抗基質干擾能力、多重檢測能力或與即時檢測設置的兼容性。
目前，關于CRISPR/Cas組分的工程化研究，如Cas蛋白、crRNA和反應緩沖液配方的系統綜述已經發表[17]、[18]。然而，作為關鍵系統的組成部分，報告分子很少受到專門的研究。2022年，M. Sohail等人對報告分子的傳感原理和應用進行了啟發性的討論[19]，但該研究并未對報告分子進行基于結構特征的詳細分類和分析。最近有一篇文章總結了一類用于增強CRISPR/Cas診斷的報告分子（高階核酸探針），但許多其他新興且關鍵的報告分子類型，如雙鏈DNA（dsDNA）報告分子、DNA-顆粒結合報告分子、水凝膠報告分子等尚未被納入[2]。因此，目前仍缺乏對這些非傳統報告分子的設計原理、工作機制、性能權衡和應用范圍的全面和最新的整合。這一空白阻礙了對Cas12a報告分子進化路徑的全面理解以及下一代生物傳感器的合理設計。因此，本綜述重點總結了基于Cas12a的生物傳感中的這些非傳統報告分子，根據它們的結構和功能特性進行分類，詳細闡述了它們的設計策略和性能優勢，討論了未解決的挑戰，并概述了未來的發展方向。本文旨在為Cas12a報告分子的創新和基于CRISPR的生物傳感平臺的臨床轉化提供理論框架和技術參考。
部分摘錄
ssDNA報告分子
經典的F-TTATT-Q報告分子在基于Cas12a的檢測方法開發中被廣泛直接采用。然而，越來越多的證據表明，ssDNA報告分子的核苷酸序列、長度和修飾類型對Cas12a系統的檢測效率有顯著影響（圖2）。一項系統研究評估了具有不同序列組成（GC富集型 vs. TA富集型）和熒光標記（FAM、HEX和Cy5）的5核苷酸報告分子
特殊構型DNA報告分子
為了克服經典ssDNA報告分子的固有局限性，研究人員創新設計了多種具有特殊構型的報告分子。如圖4所示，這些結構包括發夾結構、G四鏈體（G4）、G三鏈體（G3）、四面體DNA框架（TDF）和環狀DNA結構。以下部分將詳細闡述它們的設計理由和性能優勢，這些內容也在補充信息中的表S2中進行了總結。
DNA-顆粒結合報告分子
微納米顆粒（M/NPs）憑借其獨特的物理和化學性質，成為響應Cas12a系統的強大工具。本節探討了M/NPs與Cas12a報告分子結合的各種方式，以及這些結合對系統分析性能的影響。值得注意的是，基于CRISPR/Cas12的電化學檢測平臺已在現有文獻中得到全面綜述[43]、[44]。因此，本節DNA水凝膠報告分子
將水凝膠報告分子整合到CRISPR/Cas12a系統中可以利用其獨特性質，解決傳統檢測方法中的關鍵問題。水凝膠報告分子具有顯著優勢，包括可通過Cas12a切割活性觸發可編程的降解，從而實現信號釋放和放大的時空控制[16]。水凝膠的三維網絡結構為封裝各種信號分子提供了堅固的平臺挑戰與展望
盡管在開發基于Cas12a的生物傳感的非傳統報告分子方面取得了顯著進展，但仍需解決幾個關鍵挑戰，以充分發揮它們在臨床、環境、食品和法醫應用中的潛力。本節強調了主要瓶頸，并提出了克服這些限制的有希望的策略。
CRediT作者貢獻聲明
劉聰：撰寫——綜述與編輯、撰寫——初稿、驗證、概念化。黃玉杰：撰寫——綜述與編輯。黃楚秀：撰寫——綜述與編輯、研究、資金獲取。劉子龍：撰寫——綜述與編輯
致謝
本工作得到了國家自然科學基金（資助編號：22576075）、湖北省自然科學基金（資助編號：2023AFB1088）、湖北省司法鑒定產業研究項目（資助編號：06）、湖北警察學院的法醫學重點實驗室（資助編號：KFKT2023003）以及中國政法大學的證據科學重點實驗室開放項目的支持
