C9ORF72基因第一個內含子中的GGGGCC（G₄C₂）六核苷酸重復序列擴增是肌萎縮側索硬化癥（ALS）和額顳葉癡呆（FTD）這兩種嚴重神經退行性疾病的常見遺傳原因。該重復序列可雙向轉錄為有義的G₄C₂和反義的C₂G₄ RNA，這些RNA隨后被翻譯成五種二肽重復蛋白（DPRs）：poly-GA、poly-GP、poly-GR、poly-PA和poly-PR。含有重復序列的RNA還會聚集形成所謂的RNA焦點，這些焦點被認為通過隔離RNA結合蛋白參與了疾病的發生。區分RNA焦點和DPR毒性在制定治療策略方面至關重要，但由于DPRs是通過非起始密碼子（RAN）翻譯產生的，這一任務仍然具有挑戰性。

為了有效區分由重復RNA和DPRs介導的毒性，我們在G₄C₂重復序列上游的CUG密碼子處設計了一個單核苷酸突變。這個接近起始密碼子的位置之前已被確定為從有義RNA生成DPRs的主要起始位點。通過將這個位點從CUG突變為CCG，我們特異性地破壞了DPR的合成，同時保持了含有重復序列的RNA的表達和結構。

在一個含有66個或150個G₄C₂重復序列的小鼠模型中，通過腺相關病毒（AAV）介導的表達，單核苷酸替換（CUG→CCG）抑制了所有三種閱讀框中DPRs的翻譯。盡管CUG→CCG的突變沒有改變G₄C₂ RNA的表達水平和其形成RNA焦點的程度，但阻斷DPRs的產生完全緩解了運動和認知行為缺陷。此外，在沒有DPRs的情況下，所有測量的疾病特征都得到了改善，包括運動神經元丟失、STING激活、磷酸化TDP-43和TBK1的積累、神經炎癥以及血漿中神經絲輕鏈（NfL）水平的升高。

隨后使用CRISPR堿基編輯技術將C9ORF72患者來源的誘導多能干細胞（iPSCs）中的CUG突變為CCG。這種精確的編輯顯著減少了iPSC來源神經元中DPRs的產生，足以部分恢復多種與疾病相關的細胞表型。C9ORF72患者來源的神經元表現出轉錄組變化、STING激活、神經突起密度下降、核孔復合蛋白錯位以及存活率下降，而在CUG突變為CCG的等基因型神經元中，這些現象都得到了部分或完全恢復。

盡管RNA焦點仍然存在，但在小鼠和iPSC來源的神經元模型中，與疾病相關的表型得到了全面恢復，這提供了有力證據表明DPRs是C9ORF72 ALS和FTD發病機制的主要驅動因素。這些發現強調了針對DPR合成而非減少含有C9ORF72重復序列的RNA的替代治療策略的潛力。

C9ORF72中的GGGGCC（G₄C₂）重復序列擴增是肌萎縮側索硬化癥（ALS）和額顳葉癡呆（FTD）最常見的遺傳原因。其毒性被認為是由于含有重復序列的RNA和/或從這些轉錄本通過非起始密碼子（RAN）翻譯產生的二肽重復蛋白（DPRs）的積累所致。為了區分RNA毒性和DPR毒性，我們突變了主要用于從三種閱讀框生成DPRs的CUG密碼子。這一突變破壞了DPR的合成，同時保持了含有重復序列的RNA的表達。盡管RNA焦點仍然存在，但在C9ORF72小鼠中，行為缺陷和病理異常（包括p-TDP-43沉積、STING激活、運動神經元丟失、神經炎癥以及血漿中神經絲濃度升高）得到了緩解。CUG密碼子的堿基編輯還改善了患者誘導多能干細胞來源神經元的分子表型和存活率，這突顯了針對DPR生成而非重復RNA進行治療的潛力。