《Cell Systems》：Rewriting endogenous human transcripts with dual CRISPR-guided 3′ trans-splicing
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本研究針對RNA編輯領(lǐng)域難以實(shí)現(xiàn)高效、特異性外顯子替換的難題，開發(fā)了名為RESPLICE的雙CRISPR效應(yīng)器引導(dǎo)反式剪接技術(shù)。通過dCasRx模塊促進(jìn)靶向反式剪接，Cas7-11模塊抑制順式剪接，實(shí)現(xiàn)在3種細(xì)胞系中11個內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄本上最高45%的反式剪接效率。該技術(shù)為遺傳病治療和蛋白質(zhì)功能研究提供了可編程、瞬時的RNA編輯新工具。
在生命科學(xué)領(lǐng)域，精準(zhǔn)調(diào)控基因表達(dá)一直是研究人員追求的目標(biāo)。與傳統(tǒng)基因組編輯相比，RNA編輯具有瞬時性、可逆性和安全性高等優(yōu)勢，為治療遺傳性疾病提供了新思路。然而，現(xiàn)有的RNA編輯技術(shù)主要局限于單個核苷酸的修改或外顯子跳躍，難以實(shí)現(xiàn)大片段外顯子的替換或添加。許多疾病相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本異常，如致病性外顯子突變、蛋白質(zhì)截短或重復(fù)序列擴(kuò)展，都需要更高效的RNA編輯工具來修復(fù)。
長期以來，科學(xué)家們嘗試?yán)锰烊坏姆词郊艚樱╰rans-splicing）機(jī)制，將外源外顯子連接到目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本上。但傳統(tǒng)的RNA-only方法（如SMaRT技術(shù)）效率低下，且缺乏特異性，嚴(yán)重限制了其應(yīng)用。盡管剪接體介導(dǎo)的反式剪接在理論上具有廣闊前景，但在內(nèi)源性人類轉(zhuǎn)錄本中實(shí)現(xiàn)高效、特異性的反式剪接一直是個巨大挑戰(zhàn)。
為了解決這些問題，由Chandrasekaran, Tau等研究人員在《Cell Systems》上發(fā)表了題為“Rewriting endogenous human transcripts with dual CRISPR-guided 3′ trans-splicing”的研究論文，開發(fā)了一種名為RESPLICE（RNA-guided trans-splicing with Cas editor）的新型RNA編輯技術(shù)。該技術(shù)利用兩種不同的CRISPR效應(yīng)器，通過程序化方式促進(jìn)外顯子反式剪接到人類轉(zhuǎn)錄本中，同時抑制內(nèi)源性順式剪接（cis-splicing），實(shí)現(xiàn)了高效、特異性的轉(zhuǎn)錄本重編程。
研究團(tuán)隊主要采用了雙CRISPR效應(yīng)器策略（dCasRx和Cas7-11）、雙色熒光報告系統(tǒng)、數(shù)字液滴PCR（ddPCR）和RNA測序（RNA-seq）等技術(shù)。通過設(shè)計反式剪接模塊（TSM）和順式剪接干擾模塊（CIM），在HEK293T、Huh7和Neuro-2a細(xì)胞系中進(jìn)行了系統(tǒng)驗證。
RNA-targeting CRISPR-Cas13d guides site-specific trans-splicing
研究人員首先利用催化失活的Cas13d（dCasRx）引導(dǎo)反式剪接模塊（TSM）靶向報告基因轉(zhuǎn)錄本。通過雙色熒光報告系統(tǒng)（GFP/BFP）評估反式剪接效率，發(fā)現(xiàn)dCasRx可將效率提高約6倍，最高達(dá)到30%。通過系統(tǒng)比較多種RNA靶向CRISPR效應(yīng)器（包括hfCasRx、Cas7-11等），確定dCasRx在效率和特異性方面表現(xiàn)最優(yōu)。RNA-seq分析顯示，該系統(tǒng)具有95.3%的靶向特異性，且脫靶事件發(fā)生率低。
Inhibiting cis-splicing with a second CRISPR ribonuclease boosts trans-splicing efficiency
為了進(jìn)一步提高效率，研究團(tuán)隊引入了第二個催化活性CRISPR效應(yīng)器（CIM），用于切割目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本下游區(qū)域，抑制內(nèi)源性順式剪接。當(dāng)使用Cas7-11作為CIM時，反式剪接效率可提升1.4倍，最高達(dá)到55%。數(shù)字液滴PCR驗證表明，CIM的加入使反式剪接效率從4%提升至8%，且不降低目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本的總表達(dá)水平。
RESPLICE efficiently trans-splices cargo exons onto endogenous human transcripts
研究團(tuán)隊將RESPLICE技術(shù)應(yīng)用于11個內(nèi)源性人類轉(zhuǎn)錄本，包括ITGB1、TFRC、SMARCA4等。通過優(yōu)化TSM和CIM的靶向位點(diǎn)，在ITGB1轉(zhuǎn)錄本上實(shí)現(xiàn)了47.4%的反式剪接效率。在分選高效應(yīng)器表達(dá)的細(xì)胞中，效率可達(dá)90%。值得注意的是，該系統(tǒng)可處理長達(dá)2.1 kb的外顯子 cargo，展示了其處理大片段的能力。RNA-seq分析證實(shí)，RESPLICE在內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄本中具有高特異性，脫靶事件主要呈隨機(jī)分布，且對細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組影響較小。
RESPLICE can be used for endogenous protein tagging and pathogenic mutation correction
作為應(yīng)用示范，研究團(tuán)隊成功將GFP標(biāo)簽反式剪接到LAMP1蛋白C端，實(shí)現(xiàn)了內(nèi)源性蛋白質(zhì)標(biāo)記。在疾病相關(guān)轉(zhuǎn)錄本修正方面，RESPLICE成功靶向了HFE（遺傳性血色素沉著癥相關(guān)）、C9orf72（ALS/FTD相關(guān)重復(fù)擴(kuò)展）和TDP43（肌萎縮側(cè)索硬化癥相關(guān)）等基因。特別是在HFE轉(zhuǎn)錄本修正中，在Huh7細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了8%的效率，證明了其在治療應(yīng)用中的潛力。
研究結(jié)論表明，RESPLICE技術(shù)首次實(shí)現(xiàn)了在內(nèi)源性人類轉(zhuǎn)錄本中高效、特異性的反式剪接，突破了現(xiàn)有RNA編輯技術(shù)的局限性。通過雙CRISPR效應(yīng)器策略，該技術(shù)成功解決了反式剪接與順式剪接競爭的問題，為RNA醫(yī)學(xué)領(lǐng)域提供了新的工具。
在討論部分，作者指出剪接體的天然混雜性可能導(dǎo)致低水平脫靶反式剪接，但RNA-seq數(shù)據(jù)顯示這些事件發(fā)生頻率低于基礎(chǔ)剪接錯誤率，預(yù)計不會對細(xì)胞功能產(chǎn)生顯著影響。與研究同期發(fā)表的其他反式剪接技術(shù)（如Splice Editing、PRECISE和CRAFT）相比，RESPLICE在效率和特異性方面展現(xiàn)出獨(dú)特優(yōu)勢。
該研究的重要意義在于為遺傳病治療提供了新策略，特別是針對具有高度突變異質(zhì)性的疾病（如囊性纖維化、萊伯先天性黑蒙）或重復(fù)擴(kuò)展障礙（如ALS/FTD）。同時，RESPLICE為基礎(chǔ)研究提供了新手段，可用于蛋白質(zhì)功能研究、亞細(xì)胞定位標(biāo)記和轉(zhuǎn)錄本動力學(xué)分析。由于RNA編輯的瞬時特性，該技術(shù)還具有較高的安全性，有望成為基因治療領(lǐng)域的有力補(bǔ)充。
然而，研究也存在一定局限性，如目前僅在細(xì)胞系中驗證，尚未在動物模型或原代細(xì)胞中測試；雙蛋白系統(tǒng)的體內(nèi)遞送仍是挑戰(zhàn)；且未探索5′反式剪接的應(yīng)用。未來研究將著重優(yōu)化遞送系統(tǒng)、擴(kuò)展應(yīng)用場景，并進(jìn)一步評估其安全性和有效性。
總之，RESPLICE技術(shù)的開發(fā)標(biāo)志著RNA編輯領(lǐng)域的重要進(jìn)展，為實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)、可控的轉(zhuǎn)錄組工程奠定了堅實(shí)基礎(chǔ)，為遺傳病治療和基礎(chǔ)科學(xué)研究開辟了新途徑。
