鮭魚立克次體（Piscirickettsia salmonis）是引起鮭魚立克次體病（piscirickettsiosis）的病原體，對智利鮭魚養殖業構成重大健康威脅，并逐漸成為全球鮭魚生產的潛在風險。盡管其在 aquaculture 中具有重要地位，該菌在功能層面的研究仍相對滯后，部分原因在于其長期存在的遺傳操作難題。本研究聚焦于該菌中與自然轉化（natural transformation, NT）相關的一組基因，通過整合比較基因組學、轉錄組分析、異源基因表達以及CRISPR干擾（CRISPRi, CRISPR interference）技術，系統評估了這些基因在鮭魚立克次體生理及致病過程中的作用。

對現有全部鮭魚立克次體基因組的分析揭示了一個關鍵現象：編碼NT過程中DNA攝取通道的關鍵基因comEC，在所有菌株中均被多種轉座元件（transposable elements, TEs）所中斷，導致其編碼序列（CDS, coding sequence）片段化并失去完整開放閱讀框（ORF, open reading frame）。這種中斷在不同基因群（genogroup）中呈現出特定的結構模式，共鑒定出14種不同的基因座架構。系統發育分析表明，comEC的中斷事件在該菌進化史上發生較早且被固定下來，這可能與基因組內移動遺傳元件（MGEs, mobile genetic elements）與NT相關基因座的拮抗協同進化有關。值得注意的是，comEC的普遍失活與鮭魚立克次體對環境中抗生素抗性基因（ARGs, antibiotic resistance genes）獲取的相對“遲鈍”現象可能存在關聯，暗示其基因組景觀可能受到DNA攝取和遺傳交換長期限制的塑造。

盡管comEC失活，鮭魚立克次體基因組中仍完整保留著多個其他NT相關基因，如comEA、comFB、comM、comL（即bamD）、dprA和recA。這些基因在智利流行的兩個主要基因群代表菌株Psal-103（EM基因群）和Psal-104b（LF基因群）之間顯示出高度的序列保守性。在鮭魚頭腎來源的SHK-1細胞系感染模型中，qRT-PCR分析顯示，comFB、comL、comM和recA在感染48小時后表達顯著上調，且上調幅度在Psal-104b中通常高于Psal-103。例如，comFB在Psal-103和Psal-104b中分別上調了72倍和62倍，comM則分別上調了4.6倍和205倍。這表明這些基因在宿主細胞內相互作用過程中保持轉錄活性，提示它們可能具有獨立于NT的生物學功能。

為了探究引入功能性comEC的生理后果，研究團隊將來自天然感受態細菌（如嗜肺軍團菌Legionella pneumophila和霍亂弧菌Vibrio cholerae）的comEC同源基因，以及來自Piscirickettsia litoralis Y2（一株含有完整comEC基因的相近分離株）的comEC基因，通過IPTG誘導的迷你Tn7轉座子系統整合到鮭魚立克次體染色體中。結果表明，誘導表達嗜肺軍團菌和霍亂弧菌來源的comEC同源基因，對Psal-103和Psal-104b均造成了嚴重的生長抑制，而在固體培養基上的連續稀釋點種實驗也證實了其生存力下降。相反，表達P. litoralis Y2的comEC同源基因則未觀察到明顯的生長缺陷。RT-qPCR證實了所有構建體在IPTG誘導下均能有效轉錄。值得注意的是，在作為基因傳遞供體的大腸桿菌S17-λ pir中，即使質粒攜帶多拷貝的上述comEC基因，也未出現類似的生長抑制，表明這種毒性效應是鮭魚立克次體特異性的。這一發現為理解comEC在所有鮭魚立克次體菌株中被持續選擇性中斷提供了可能的解釋：引入某些功能性comEC同源基因會帶來顯著的適應性代價。

研究利用CRISPRi技術，在Psal-103和Psal-104b中分別條件性敲低了comFB、comL/bamD、comEA、comM、dprA和recA這六個NT相關基因，以評估它們在對數期無細胞培養基生長和SHK-1細胞感染模型中的重要性。

在無細胞培養基中，CRISPRi介導的comL/bamD抑制對Psal-104b的生存力造成了嚴重損害，表明該基因對于LF基因群代表菌株在無細胞條件下的生長是必需的。然而，在Psal-103中抑制comL/bamD或其他任何目標基因，均未檢測到對生長的顯著影響，提示comL/bamD表現出基因群特異性的必需性。comL最初在淋病奈瑟菌中被鑒定為NT所必需的脂蛋白，后續研究發現其編碼高度保守的周質脂蛋白BamD，是大多數革蘭氏陰性菌中β-桶狀組裝機器（BAM, β-barrel assembly machinery）的一個組成部分。BAM復合物負責外膜蛋白的正確插入和折疊，其中BamD在許多物種中與核心組分BamA一樣是維持生命所必需的。

在SHK-1細胞感染實驗中，誘導CRISPRi抑制目標基因表達。結果發現，抑制comL/bamD不僅導致Psal-104b（如前所述，其在無細胞條件下即致死）幾乎完全喪失細胞病變效應，也在Psal-103中顯著降低了細胞病變活性（約為野生型的85%），表明該基因在感染過程中具有重要作用，盡管其在Psal-103的無細胞培養基中非必需。

抑制comM在Psal-103和Psal-104b中均顯著降低了細胞病變效應，提示其在感染相關過程中具有保守功能。抑制comFB在Psal-104b中引起感染進程的輕微延遲，但在Psal-103中無此現象。recA的抑制僅在Psal-103中導致細胞病變效應顯著降低，而在Psal-104b中無影響，反映了基因群間在DNA修復和應激反應動態方面的潛在差異。對于comEA和dprA，在Psal-104b中未檢測到表型效應；在Psal-103中，抑制comEA與細胞病變效應的適度但顯著的減少相關，而抑制dprA則未產生統計學上顯著的效應。

這些功能分析結果表明，盡管鮭魚立克次體失去了進行自然轉化的核心能力（由于comEC的失活），但其基因組中保留的多個NT相關基因仍然以基因特異性及基因群特異性的方式，貢獻于細菌的適應性，特別是在宿主細胞內生存和致病的環境中。例如，comL/bamD在Psal-104b中的必需性及其在Psal-103感染中的重要性，凸顯了BAM復合物在細菌包膜穩態和致病性中的關鍵作用。comM在感染中的保守角色則暗示其可能參與如應激耐受或毒力相關通路等過程。

本研究不僅揭示了鮭魚立克次體中NT相關基因在NT功能喪失背景下的演化命運和當代功能，更重要的是，建立了一個結合CRISPRi、位點特異性染色體整合和異源基因表達的多功能遺傳學平臺，為未來深入探索該病原體的生物學特性、開發新的生物技術控制策略奠定了基礎。研究中觀察到的Psal-103和Psal-104b之間的表型差異，也強調了在針對該病原體的研究和管理策略中，需要考慮其基因群多樣性。