在生命科學(xué)的精密調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，基因表達(dá)調(diào)控始終是核心議題。作為轉(zhuǎn)錄起始的關(guān)鍵控制點(diǎn)，啟動(dòng)子通過(guò)整合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、表觀遺傳修飾等信號(hào)，決定基因的轉(zhuǎn)錄輸出。特別有趣的是，許多蛋白編碼基因采用多個(gè)啟動(dòng)子（即替代啟動(dòng)子），這些啟動(dòng)子能夠產(chǎn)生不同的轉(zhuǎn)錄本亞型，從而顯著增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄組的復(fù)雜性，實(shí)現(xiàn)組織特異性表達(dá)和對(duì)生理刺激的動(dòng)態(tài)響應(yīng)。

在造血系統(tǒng)中，這種調(diào)控機(jī)制顯得尤為重要。造血過(guò)程需要精確的轉(zhuǎn)錄調(diào)控來(lái)支持多樣化免疫細(xì)胞群體的發(fā)育和進(jìn)一步亞群分化。例如，RUNX1基因通過(guò)遠(yuǎn)端P1和近端P2啟動(dòng)子分別產(chǎn)生Runx1c和Runx1b亞型，在巨核細(xì)胞特化、成熟和血小板生成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。類(lèi)似地，SATB1基因在胸腺細(xì)胞中利用四個(gè)替代啟動(dòng)子，其使用模式隨著發(fā)育過(guò)程動(dòng)態(tài)變化，且依賴(lài)于TCR信號(hào)。這些研究都表明替代啟動(dòng)子在造血和免疫細(xì)胞發(fā)育中具有重要功能。

然而，盡管個(gè)別基因的啟動(dòng)子功能已有研究，但由于技術(shù)限制（如批次效應(yīng)和階段覆蓋不足），對(duì)造血過(guò)程中啟動(dòng)子活性動(dòng)態(tài)的系統(tǒng)性分析仍然缺乏。傳統(tǒng)方法如CAGE（基因表達(dá)帽分析）在全面揭示替代啟動(dòng)子使用方面存在局限。隨著高通量RNA測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在可以通過(guò)深度批量RNA-seq數(shù)據(jù)同時(shí)量化啟動(dòng)子活性和揭示替代使用情況，為系統(tǒng)性研究提供了新的機(jī)遇。

在這項(xiàng)發(fā)表于《Stem Cell Reports》的研究中，張寶軍團(tuán)隊(duì)通過(guò)分析532個(gè)RNA測(cè)序數(shù)據(jù)集，構(gòu)建了造血過(guò)程中高分辨率的啟動(dòng)子活性圖譜，揭示了替代啟動(dòng)子在造血譜系中的關(guān)鍵作用。

研究人員主要運(yùn)用了幾項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)：首先，利用proActiv工具對(duì)532個(gè)造血干細(xì)胞、前體細(xì)胞和終末分化譜系的RNA-seq數(shù)據(jù)集進(jìn)行啟動(dòng)子活性定量分析；其次，通過(guò)CRISPRi（dCas9-KRAB）系統(tǒng)進(jìn)行啟動(dòng)子特異性轉(zhuǎn)錄抑制實(shí)驗(yàn)；第三，采用ATAC-seq、ChIP-seq和Hi-C技術(shù)分析染色質(zhì)可及性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合和三維基因組構(gòu)象；此外，還通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證了啟動(dòng)子功能及其對(duì)翻譯效率的影響。值得注意的是，所有實(shí)驗(yàn)使用的樣本均來(lái)自公共數(shù)據(jù)庫(kù)和實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的小鼠模型，包括NSG（NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl/SzJ）小鼠。

通過(guò)分析532個(gè)RNA-seq數(shù)據(jù)集，研究人員構(gòu)建了涵蓋57種細(xì)胞類(lèi)型的啟動(dòng)子活性圖譜。他們發(fā)現(xiàn)約10%的蛋白編碼基因啟動(dòng)子在所有樣本中被分類(lèi)為主要啟動(dòng)子，20%為次要啟動(dòng)子，其余在造血發(fā)育過(guò)程中未檢測(cè)到激活。主要啟動(dòng)子主要位于最5'端位置，而次要啟動(dòng)子在下游位置比例逐漸增加，表明基因亞集存在活躍的下游啟動(dòng)子。聚類(lèi)分析顯示，啟動(dòng)子活性譜能夠?qū)⑾嚓P(guān)細(xì)胞類(lèi)型聚集在一起，反映了細(xì)胞類(lèi)型特異性調(diào)控。

研究人員重點(diǎn)關(guān)注了動(dòng)態(tài)啟動(dòng)子行為，發(fā)現(xiàn)11,907個(gè)啟動(dòng)子在造血分化過(guò)程中經(jīng)歷了從次要/非活躍狀態(tài)到主要狀態(tài)的轉(zhuǎn)變。序列分析顯示，主要啟動(dòng)子中的TATA框和YY1基序具有明確的空間模式，與轉(zhuǎn)錄方向一致，而次要啟動(dòng)子中這些基序的方向一致性?xún)H為約50%，表明主要啟動(dòng)子主要依賴(lài)經(jīng)典轉(zhuǎn)錄機(jī)制，而次要啟動(dòng)子可能通過(guò)替代轉(zhuǎn)錄機(jī)制運(yùn)作。

通過(guò)主成分分析，研究人員鑒定了1,074個(gè)高影響力啟動(dòng)子，這些啟動(dòng)子對(duì)應(yīng)的基因包括轉(zhuǎn)錄因子、支架蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等。其中68%的啟動(dòng)子調(diào)控參與造血/免疫調(diào)節(jié)的基因。他們特別關(guān)注了Ikzf1和Pou2f1基因，發(fā)現(xiàn)Ikzf1的P1啟動(dòng)子在B細(xì)胞和單核細(xì)胞中活躍，而P2啟動(dòng)子主要在T細(xì)胞中活躍；Pou2f1的P1啟動(dòng)子在T/NK細(xì)胞/單核細(xì)胞中活躍，而P2啟動(dòng)子具有B細(xì)胞/祖細(xì)胞特異性。

通過(guò)ATAC-seq分析和motif富集分析，研究人員發(fā)現(xiàn)Pou2f1和Ikzf1啟動(dòng)子使用受到特定轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。相關(guān)性分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證表明，Spi1調(diào)控Ikzf1 P1，F(xiàn)oxo1調(diào)控Ikzf1 P2，Yy1調(diào)控Pou2f1 P1，Pax5調(diào)控Pou2f1 P2。染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序證實(shí)了這些因子在相應(yīng)啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合。

研究人員發(fā)現(xiàn)Pou2f1和Ikzf1啟動(dòng)子使用影響5'非翻譯區(qū)（5'UTR）特征，進(jìn)而調(diào)控翻譯效率。特別是Pou2f1的P2來(lái)源的5'UTR比P1來(lái)源的5'UTR具有顯著更高的翻譯效率，這解釋了為什么Pou2f1在B細(xì)胞中的蛋白水平遠(yuǎn)高于T細(xì)胞。

通過(guò)CRISPRi實(shí)驗(yàn)，研究人員發(fā)現(xiàn)抑制Pou2f1 P1啟動(dòng)子顯著降低了T細(xì)胞、髓系細(xì)胞和NK細(xì)胞的重建，而抑制P2啟動(dòng)子選擇性損害了B細(xì)胞發(fā)育，表明P1啟動(dòng)子在多種造血譜系中具有廣泛功能，而P2啟動(dòng)子具有B細(xì)胞特異性作用。

Hi-C分析揭示了B細(xì)胞特異的染色質(zhì)環(huán)連接Pou2f1的P1和P2啟動(dòng)子，而在T細(xì)胞中，P1與Cd247基因的啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)相互作用。這種細(xì)胞類(lèi)型依賴(lài)的染色質(zhì)構(gòu)象差異表明P1在T細(xì)胞中作為典型啟動(dòng)子，而在B細(xì)胞中獲得增強(qiáng)子樣特性。

本研究通過(guò)系統(tǒng)性轉(zhuǎn)錄組分析，構(gòu)建了小鼠造血過(guò)程中啟動(dòng)子活性的動(dòng)態(tài)圖譜，為理解基因表達(dá)調(diào)控提供了寶貴資源。研究發(fā)現(xiàn)不僅證實(shí)了替代啟動(dòng)子在造血譜系分化中的關(guān)鍵作用，還揭示了其通過(guò)5'UTR多樣性影響翻譯效率的新機(jī)制。

特別值得注意的是，研究發(fā)現(xiàn)了啟動(dòng)子-啟動(dòng)子相互作用的現(xiàn)象，即同一基因的主要和次要啟動(dòng)子之間可以形成染色質(zhì)環(huán)，這種相互作用具有細(xì)胞類(lèi)型特異性。在Pou2f1基因座中，P1啟動(dòng)子在B細(xì)胞中表現(xiàn)出增強(qiáng)子樣功能，調(diào)控P2啟動(dòng)子的活性，這擴(kuò)展了我們對(duì)啟動(dòng)子功能多樣性的認(rèn)識(shí)。

從機(jī)制層面，研究明確了Spi1、Foxo1、Yy1和Pax5等轉(zhuǎn)錄因子作為上游調(diào)控因子，直接決定了Ikzf1和Pou2f1替代啟動(dòng)子的細(xì)胞類(lèi)型特異性使用。這些發(fā)現(xiàn)為理解造血和免疫細(xì)胞發(fā)育中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了重要見(jiàn)解。

這項(xiàng)研究的臨床意義在于，由于異常啟動(dòng)子使用與多種疾病特別是癌癥相關(guān)，該研究建立的平臺(tái)和方法為靶向疾病中啟動(dòng)子特異性機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。未來(lái)可能通過(guò)調(diào)控特定啟動(dòng)子的使用，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的精確干預(yù)，為疾病治療提供新策略。

總之，該研究將替代啟動(dòng)子定位為造血和免疫細(xì)胞分化中的動(dòng)態(tài)調(diào)控樞紐，深化了對(duì)基因表達(dá)控制的理解，并為發(fā)育和疾病中的未來(lái)研究建立了概念基礎(chǔ)。