在多年生高山南芥（Arabis alpina）中，初級枝條和腋生枝條的開花受到差異性調控。盡管春化作用和衰老途徑的貢獻已被分析，但光周期開花基因CONSTANS（CO）、FLOWERING LOCUS T（FT）和TWIN-SISTER OF FT（TSF）的作用仍未探索。本研究通過CRISPR-Cas9技術獲得了AaCO和AaFT/TWIN SISTER OF FT-LIKE（TSFL）的突變，并在pep1背景中對Aaco和Aaft/tsfl突變體在長日照（LD）或短日照（SD）以及春化處理后的開花時間、花序分枝和花表型進行了評估。通過比較初級枝和腋生枝的RNA-seq數據，發現AaCO在葉片中激活AaFT/TSFL的轉錄，Aaco和Aaft tsfl突變在LDs下延遲開花。Aaco突變體的腋生枝能開花，而Aaft tsfl突變體的腋生枝則不能。兩種突變體在LDs下的初級枝條都缺乏花序分枝和花。然而，Aaft tsfl突變體在春化后能產生一些花，Aaco在SDs下也能產生少量花。RNA-seq鑒定出了在初級枝條和腋生枝中響應AaFT、TSFL和AaCO的基因。因此，AaCO-AaFT促進A. alpina在LDs下開花，但在腋生枝開花中具有獨特作用。這兩個基因都是初級枝條上花序分枝和花形成所必需的。CO-FT模塊在花序結構中的復雜作用可能是A. alpina多果、多年生生活史的基礎。

被子植物的繁殖策略具有高度可變性，其生活史可能是一年生、二年生或多年生的。大多數被子植物物種是多年生的，但一年生植物已多次獨立進化。這些生活周期的差異對植物的生態學和競爭力具有深遠影響，并且在很大程度上取決于分生組織命運的變異。一年生植物如擬南芥（Arabidopsis thaliana）經歷快速的、單季節生長，莖頂端分生組織（SAM）和腋生分生組織（AMs）轉變為生殖生長。然后植物結實并衰老，所有分生組織被消耗。相比之下，多年生植物如高山南芥（Arabis alpina）可存活數年，在營養期和生殖期之間交替。一些AMs保持營養生長狀態，而另一些則經歷花轉變，營養枝進入休眠以再生新的生長。十字花科已成為理解生活史多樣化遺傳學的模型，因為姐妹一年生和多年生物種已獨立進化多次。

十字花科植物生活周期差異的基礎在于MADS結構域家族中的開花抑制因子，特別是在與FLOWERING LOCUS C（FLC）相關的支系中。在擬南芥中，FLC賦予對冬季寒冷（春化）的開花響應。低溫暴露使FLC轉錄沉默，并且通過FLC基因座處穩定的組蛋白修飾，這種抑制在回歸溫暖條件后仍持續存在。FLC的穩定抑制使得SAM和所有AMs形成花，導致種子產生。在多年生A. alpina中，FLC直系同源基因PERPETUAL FLOWERING 1（PEP1）在春化期間被抑制，允許所有分生組織發生花轉變。然而，在回歸溫暖后，PEP1的轉錄被重新激活，維持尚未經歷花轉變的分生組織處于營養狀態。在A. alpina和其他幾種十字花科物種中，FLC直系同源基因的突變導致連續開花，即所有AMs獨立于春化而開花。與FLC相關的MADS AFFECTING FLOWERING（MAF）家族基因以及相關的FLOWERING LOCUS M（FLM）或MAF-RELATED（MAR）家族也有助于十字花科多年生植物中開花的抑制，并且可能與FLC直系同源基因完全冗余。

除了春化作用，其他環境和發育信號通過一個優化繁殖時間的通路網絡控制擬南芥中的花轉變。 among these pathways is one involving the SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE (SPL) transcription factors, which are negatively regulated by miR156. MIR156 genes的轉錄在老株中被抑制，允許SPLs表達，因此，該通路被認為是與年齡相關的開花途徑。SPL15受到miR156的負調控，并且也被FLC轉錄抑制，使其成為年齡相關和春化途徑的關鍵匯聚點。在多年生物種中，這種相互作用使得對春化的開花響應具有年齡依賴性。

與春化和衰老相反，光周期途徑在調節A. alpina及相關多年生植物花轉變中的作用仍未得到充分探索。這種廣泛保守的途徑在使開花與波動的日長同步方面很重要，并且可能是理解A. alpina如何在其高海拔或高緯度棲息地最大化其繁殖成功的關鍵。擬南芥和許多其他十字花科物種是兼性長日（LD）植物，當在每個24小時周期內暴露于長光周期時開花更早。擬南芥暴露于長光周期導致CONSTANS（CO）基因轉錄增加以及其編碼的B-box轉錄因子的穩定。CO然后激活韌皮部伴細胞中FT及其旁系同源基因TWIN SISTER OF FT（TSF）的轉錄。FT成花素蛋白通過韌皮部運輸到SAM，在那里啟動花轉變。在非誘導性短日（SD）下，開花通過SPL轉錄因子的活性獨立于CO-FT模塊發生。CO和FT直系同源基因在草本多年生植物中的作用尚未被詳細研究。然而，FT基因與擬南芥的多年生親屬lyrate arabidopsis的開花控制、林地黃莓的花序發育以及多年生樹木芽休眠的調節有關。

我們研究了CO-FT調節模塊在模型多年生植物A. alpina開花中的功能。利用CRISPR-Cas9，我們在A. alpina的CO和FT/TSF基因中產生了突變，并在pep1突變背景中分析了它們的效果。我們發現FT或CO基因的突變強烈延遲開花，但對初級枝條（PS）上的花序發育有意想不到的強烈影響，使得突變體未能形成花序分枝（花序階段1，I1）或花（花序階段2，I2）。此外，我們發現，在葉腋處形成的腋生枝（ABs，V1）上，Aaco pep1突變體開花，而Aaft tsfls pep1突變體在這些ABs上不形成花。我們討論了這些基因對A. alpina多年生生活史的影響。

進行了同線性分析以研究多個Arabis物種和擬南芥之間基因的基因組組織和保守性。使用Pac-Bio長讀長、雙末端測序生成了高山南芥（Arabis alpina）材料的基因組序列數據。所有獲得的讀數使用已發表的Pajares參考基因組進行比對。從Arabis物種和擬南芥的基因組序列中檢索目標基因的基因組序列。首先使用Blast重新分析序列并將其比對到各自的基因組。仔細驗證并必要時調整基因模型以確保正確比對。使用R中ggplot2包的自定義腳本通過比較物種間的保守區域來識別同線性塊。此外，考慮到Arabis中常見的基因復制，在比對過程中允許重復比對以確保捕獲所有相關的旁系同源基因。AaFT基因先前被稱為AaFT1至AaFT4；然而，基于此處的同線性分析，它們被重命名為AaFT、TSFL1、TSFL2和TSFL3。

使用AaCO、AaFT和TSFLs的蛋白質序列構建了系統發育樹。使用默認參數的MUSCLE算法比對氨基酸序列。使用MEGA11中實施的Maximum Likelihood方法構建系統發育樹，應用LG替代模型，該模型因其在蛋白質序列進化方面的性能而被選擇。通過100次bootstrap重復評估樹拓撲的統計支持。

在LD和SD條件下生長的植株完全展開的第五片葉上進行晝夜基因表達分析。對于每種基因型，在LD下每2小時、SD下每3小時收集三個生物學重復。使用RNeasy kit提取總RNA，并使用Turbo DNAse kit處理1 μg總RNA。使用oligo(dT)18引物和Superscript II逆轉錄酶按照制造商說明進行cDNA合成。使用BioRad iQ5 apparatus和SYBR Green I detection進行定量實時RT-PCR，使用2 μl cDNA:H₂O的1:10稀釋液。使用Arabis alpina PROTEIN PHOSPHATASE 2A（AaPP2A）作為參考基因標準化表達數據。使用2^?ΔΔCt方法確定相對基因表達。

通過在LD或SD條件下生長的植株的葉片、花和長角果的RNA進行qRT-PCR分析AaFT、TSFL和AaCO基因表達的組織特異性。在各自生長條件下萌發后5周進行轉移實驗。進行時間序列實驗，分別在LD的ZT16和SD的ZT8時間點每周（LD）或每兩周（SD）收獲葉片樣本。每周收獲一個新完全形成的葉片用于測量mRNA表達。從經過春化的植株上收獲花和長角果。收獲最先開放的兩朵完全開放的花和授粉后6天的幼嫩長角果用于RNA分離。

使用多年生西班牙高山南芥材料“Pajares”來分析光周期途徑基因的表達。為了產生CRISPR-Cas9突變系，使用pep1突變植株，因為它們從所有分生組織持續開花，導致形成更多的花，從而提高了轉化效率。此外，我們使用pep1背景來研究光周期對獨立于春化在所有ABs上產生花的A. alpina植株的影響。種子在4°C黑暗中層積3天，植株在可控溫室條件或生長箱中生長，分別在SD（8小時光照:16小時黑暗）或LD（16小時光照:8小時黑暗）下，光強為200至500 μmol m^?2s^?1，溫度22°C。植株在4°C、光強14 μmol m^?2s^?1的生長箱中在LD或SD下進行春化。從萌發開始計算到第一朵花開放的天數（DTFO）。表型分析使用5到15株植株。

從在不同條件下生長的植株收獲SAMs。每個時間點每個基因型分析三個分生組織。在冰上收獲頂端分生組織，并用4%多聚甲醛的PBS溶液通過真空滲透三次，每次10分鐘進行固定。然后將樣品在黑暗中孵育過夜，并用PBS緩沖液洗滌兩次，每次10分鐘。使用ClearSee澄清組織直至透明。將SCRI Renaissance 2200細胞壁特異性標記物添加到ClearSee溶液中，并將樣品在室溫下黑暗保存直至成像。使用Leica SP8共聚焦顯微鏡獲取具有z-stack間隔的共聚焦圖像。

使用兩個靶位點敲除A. alpina中的AaFT以及TSFL1、TSFL2和TSFL3基因。靶點1（5′-ACGGATATTCCTGCCACAAC-3′）特異性針對AaFT的外顯子3，靶點2（5′-AGTCCAAGCAACCCTTACC-3′）在TSFL1、TSFL2和TSFL3的外顯子2中保守。對于AaCO，使用了外顯子1中的兩個靶位點（5′-CGAGTCATGTGAGCGTGCCC-3′和5′-CGAGACAACAATGACCAATC-3′）。按照所述方法克隆guide RNAs。將最終的雙元質粒克隆到根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株GV3101（pSOUP）中。通過pep1植株的花序浸漬轉化后，在含有不含蔗糖的MS培養基和100 mg ml^?1潮霉素的固體瓊脂平板上篩選T₀種子。根據更長的下胚軸和根選擇陽性轉化體，并移栽到土壤中。通過PCR驗證轉化體中外源基因的存在。為了鑒定基因編輯，用基因特異性引物擴增基因，并將得到的PCR擴增產物克隆到pGEM-T載體中，并通過Sanger測序進行測序。

用AaFT-TSFL-sgRNA-Cas9-Hyg cassette轉化在pep1背景中產生了28個T₁代轉化體，對每個轉化體中的AaFT和TSFL基因測序揭示了Aaft和tsfl突變的各種組合。T₁植株的自花授粉導致T₂代中出現各種突變基因型， either through segregation of edited alleles identified in the T₁or the identification of newly edited alleles。選擇突變體通過后續世代繁殖，直到目標突變純合。類似地，當使用AaCO-sgRNA-Cas9-Hyg cassette轉化時，獲得了10個T₁代轉化體。選擇兩個具有移碼缺失的突變體進行進一步分析。這些植株自花授粉產生T₂和T₃代，然后用于表型分析。

在時間序列上對在LDs下生長的植株材料進行RNA-seq分析，并在ZT16收獲組織。在每個時間點收獲SAMs和AMs用于RNA測序分析。在立體顯微鏡下切除富含SAM的頂端組織，并去除可見的葉原基。從BGI Poland獲得了總共約每樣本2000萬條100 bp雙末端讀長。使用Galaxy處理原始測序數據。使用STAR將讀數比對到A. alpina參考基因組，并使用FeatureCounts生成基因水平計數。使用DESeq2中位數比率法進行標準化，該方法校正了樣本間測序深度和RNA組成的差異。使用DESeq2 Wald檢驗進行差異基因表達分析，以計算每個基因的log₂FC和相關P值。使用Benjamini–Hochberg錯誤發現率校正對P值進行多重檢驗校正以控制I類錯誤。

使用ClusterProfiler進行Gene Ontology（GO） term富集分析，重點關注具有擬南芥注釋的生物學過程術語。為了減少富集GO terms之間的冗余，使用rrvgo進行基于語義相似性的聚類。

為了最小化表型可塑性，將植株隨機分配到溫室艙室中。數據表示為來自三到五個獨立生物學重復的平均值±SD，具體取決于實驗類型。使用單因素ANOVA評估不同組平均值之間的統計顯著性，然后進行Tukey事后檢驗或Wilcoxon檢驗。差異在，P < 0.05時認為顯著，在，P < 0.01時高度顯著，在**，P < 0.001時非常高度顯著。使用R Studio生成圖表用于分析和繪圖。

使用充分表征的西班牙材料Pajares研究草本多年生植物A. alpina中的CO-FT模塊。在A. alpina染色體8上鑒定了一個CO同源基因，其側翼是擬南芥中CO鄰近基因的直系同源基因（At5G15830和AT5G15850（AtCOL1））。系統發育分析證實它與AtCO的關系比與其他AtCOL蛋白的關系更近，支持其作為AtCO直系同源基因的身份。此外，鑒定了四個FT同源基因。其中一個基因AaFT與擬南芥的FT和FAS1具有同線性保守性，并且先前被命名為AaFT1。然而，其他三個基因與FT或其旁系同源基因TSF沒有顯示出同線性保守性。對擬南芥的FT和TSF蛋白序列以及在高山南芥材料和相關物種中鑒定出的FT同源物蛋白序列進行了系統發育分析。該分析表明AaFT與FT存在于同一支系中，與同線性保守性一致。然而，其余三個蛋白與擬南芥的TSF關系更近。因此，我們將相應的基因命名為TWIN SISTER OF FT-LIKE（TSFL1）、TSFL2和TSFL3。FT和TSFL2亞支包含所有Arabis物種的蛋白。然而，TSFL1僅在A. alpina材料中發現，表明它可能是在A. alpina譜系中通過復制相對較近期產生的。

然后研究了需要春化才能開花的A. alpina材料Pajares及其不依賴春化開花的突變體pep1的光周期開花響應。兩種基因型在22°C的LD下生長5周，然后在4°C下進行12周SD春化，然后返回22°C的LD。Pajares在返回22°C的LD后2周形成可見的花蕾，而pep1在返回相同條件時已經具有花蕾。然后將兩種基因型的10周齡植株在連續SDs下生長，并暴露于春化12周。Pajares在PS上形成可見的花蕾，但這些花蕾在返回溫暖SDs后10周未能進一步發育。此外，即使在返回溫暖SDs后10周，Pajares也未在AB（V1）上形成任何花蕾。相比之下，pep1植株在返回溫暖SDs后5周內在PS上開花，但隨后在形成更多花之前逆轉形成葉，最終枝條終止于一個花蕾。為了解耦春化和光周期效應，將pep1植株在連續LD和SD條件下生長。植株在LDs下比在SDs下開花早，并且在SDs下，PS的結構顯示休眠芽、營養枝，并終止于少數幾朵花。在LDs下，pep1植株形成最終開花的V1分枝，隨后是I1分枝，然后是PS上的單生花。然而，在SDs下，pep1突變體產生更多的V1分枝。這些之后是幾個含有休眠芽的節，然后是苞片支撐的花和少數單生花。休眠芽出現在預期形成腋生I1分枝的位置，并且在SDs下沒有I1分枝發育。在春化前后在連續SDs下生長的Pajares植株中，花轉變不完全，植株顯示敗育的花蕾。這些發現表明A. alpina是一種兼性LD植物，并且光周期對開花時間和花序發育都有強烈影響。

為了進一步剖析光周期對開花的控制，在光周期結束時（LDs為ZT16，SDs為ZT8）測量了葉片中AaCO和AaFT/TSFL mRNA水平，植株在模擬自然條件下生長（5周LD 22°C → 12周SD 4°C → LD 22°C）。RT-qPCR分析顯示，AaFT mRNA水平在LDs下相對較高，而TSFL基因在相同條件下表達水平較低。相比之下，在SDs 4°C下，年幼（L17）和年老（L1）葉片中AaFT/TSFL2 mRNA的豐度極低。返回LD，22°C后，春化后新形成的（L20）和已形成的（L1）葉片中AaCO、AaFT和TSFL2的表達增加，與花轉變和花序發育相關。為了進一步驗證在SD 4°C下AaCO/AaFT/TSFLs表達的降低，進行了轉移實驗，保持恒定的發育生長周期。植株在22°C的SDs下生長5周，然后轉移到4°C，在SDs或LDs下進行春化。僅在暴露于LD條件的植株葉片中AaCO和AaFT的表達增加。這一結果與先前檢測到的SDs下的低表達水平一致。除了這些實驗，使用pep1植株在連續LD條件下測量表達譜，因為我們使用該基因型產生CRISPR突變體。在連續LDs下，表達譜與LD寒冷實驗中觀察到的相似。與這一結果一致，pep1在LDs下比在SDs下開花早。

為了對AaCO-AaFT/TSFL模塊進行遺傳鑒定，在pep1背景中創建了AaCO、AaFT和TSFLs的CRISPR-Cas9誘導突變。回收了兩個Aaco突變體，分別包含8-bp缺失或1-bp插入，稱為Aaco-1 pep1和Aaco-2 pep1。表型分析顯示，在LDs下，兩個Aaco pep1突變體都比pep1開花晚，并且僅從V1 ABs開花。在PS上，Aaco pep1突變體從未產生典型的I1分枝或pep1花序特有的單生花。這種表型表明PS的開花比V1 ABs的開花更依賴于涉及AaCO的調節途徑。為了研究AaCO對PS和V1 ABs的差異效應是否由AaFT和TSFL介導，回收了這些基因的突變。在T₁代轉化體中獲得了三個五重突變體（Aaft tsfl1 tsfl2 tsfl3 pep1（以下簡稱Aaft tsfls-1 pep1至Aaft tsfls-3 pep1））。這些突變體不形成花，但在預期I1節的位置形成休眠芽，如在LDs下的Aaco pep1突變體和SDs下的pep1中所觀察到的。pep1和Aaft tsfls-1 pep1突變體在6周時的SAM的共聚焦成像顯示，pep1突變體已經形成花原基，但Aaft tsfls-1 pep1的SAM仍然是營養性的。到28周時，許多pep1突變體的花序已經衰老，但Aaft tsfls-1 pep1五重突變體繼續形成營養葉直到實驗結束41周。這些實驗表明AaFT和TSFL基因對于LDs下pep1突變體的開花是必需的。

然后在LDs和SDs下22°C的葉片中測量了AaFT和TSFL基因的mRNA豐度。與先前在擬南芥中的研究結果一致，在pep1植株中，AaFT和AaCO mRNA水平在ZT14光周期結束時達到峰值，并在夜間降低。在ZT4觀察到TSFL1 mRNA豐度的一個小峰值，而TSFL2 mRNA在ZT4和ZT14都顯示峰值。未檢測到TSFL3 mRNA。與pep1植株中的水平相比，Aaco pep1突變體葉片中AaFT和TSFL mRNAs的水平降低到不可檢測的水平。

一年生擬南芥植株最終在SDs下開花并形成正常的花序，證明光周期非依賴途徑可以覆蓋其LD需求。我們測試了Aaco pep1和Aaft tsfls pep1突變是否增強了在SDs下觀察到的pep1的晚花和受損的花序發育表型。在SDs下，Aaco pep1突變體與pep1突變體開花時間相似，但值得注意的是，在這些條件下，Aaco pep1突變體在PS上形成一些花，并且在ABs上也形成花，而它們在LDs下的PS上則不形成。Aaft tsfls-1 pep1在LDs和SDs下顯示出相似的生長模式，并且在SDs下生長時所有節均未能轉變為開花。總之，所有AaFT和TSFL基因均失活的植株在LDs下未能形成I1分枝或花，強調了它們在花誘導和花序發育中的重要作用，而缺乏AaCO的植株僅在PS上未能開花。此外，在SDs下，Aaft Aatsfls pep1突變體不形成花，強調了AaFT和TSFL基因在非誘導條件下花序發育中的重要性。

為了解決每個FT/TSFL基因的個體貢獻，在pep1背景中產生了AaFT、TSFL1、TSFL2和TSFL3的所有雙突變和三重突變，并與先前描述的高階突變體一起進行表型分析。對每種基因型的開花時間、PS上的單生花形成、I1分枝和AB（V1）開花進行評分。在LDs下，所有雙突變體開花都顯著晚于pep1。pep1突變體形成約13個V1節，隨后約3個I1分枝，然后10-20朵單生花（I2）。Aaft-1 pep1和Aaft-2 pep1突變體最終形成約30個遠端部分營養的V1節。隨后形成20-30個額外的近端節，產生類似于在SDs下pep1中觀察到的更簡單的V1分枝。一些植株然后形成由苞片支撐的花狀結構，然后逆轉產生葉。Aaft-1 pep1和Aaft-2 pep1突變體從未形成單生花。每個tsfl pep1突變體發育的V1節數顯著多于pep1突變體，只有tsfl1 pep1產生I1分枝并最終形成一些含有單生花的節。四個AaFT和TSFL基因的突變等位基因的組合導致更極端的晚花和受損的花序發育表型。幾個三重突變組合在PS花序上表現出營養特征，例如苞片的形成和逆轉形成葉，表明花序分生組織身份的維持受損。四重突變體不形成單生花，但在產生約30個營養節在V1區后，產生約30個含有一個葉及其腋中休眠芽的節。在pep1背景中含有Aaft和tsfl突變組合的四重突變體在初級SAM上不開花，并持續營養生長直至實驗結束（200天）。

許多A. alpina材料表現出強制性的春化要求，具有顯性PEP1表達才能開花。值得注意的是，pep1敲除突變體仍然對春化有響應，導致與未春化植株相比開花加速。因此，對Aaft tsfls pep1突變體進行春化以評估這是否會克服它們不開花的能力。在22°C的LDs下生長5周的植株暴露于4°C的SDs下12或24周春化，然后返回22°C的LDs。暴露于12周SD春化后，返回LDs后1周在pep1植株上存在可見的花蕾，而在五重突變體上，花蕾的出現嚴重延遲，僅在返回LDs后20周發生。此外，突變體僅形成少數畸形花，然后PS通過首先形成苞片支撐的花，然后形成葉而逆轉為營養發育。因此，Aaft tsfls pep1五重突變體的開花確實在12周SD春化后發生，但與對照pep1植株相比極度延遲，并且僅產生少數花。與AaFT和TSFL2在12周春化后pep1突變體開花中的作用一致，在pep1和Pajares的幼嫩和成熟葉片中，春化后都檢測到這兩個基因以及AaCO的表達。

然后將Aaft tsfls pep1突變體置于SDs下更長的24周春化期。經過這種處理后，突變體