《Plant Biotechnology Journal》：Knocking Out Two Polyphenol Oxidase Genes Significantly Improves Recombinant Protein Purification in Nicotiana benthamiana
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本研究通過CRISPR-Cas9技術敲除本氏煙中兩個關鍵多酚氧化酶基因（PPOa和PPOb），成功構建了高效重組蛋白表達平臺。該平臺顯著降低了多酚介導的蛋白聚集現象，使SARS-CoV-2 Spike三聚體（St）和流感血凝素三聚體（HAt）的純化產量提升40%-70%，為植物分子農業（PMF）提供了革命性的技術突破。
引言：底盤工程推動合成生物學發展
底盤工程在合成生物學領域發揮著關鍵作用。微生物和哺乳動物細胞底盤的設計優化已成功實現多種生物制品的高效生產，包括阿片類藥物、維生素B12、托烷類生物堿、抗體和亞單位疫苗。植物分子農業作為替代方案，近年來在重組亞單位疫苗生產方面取得顯著進展，例如完成III期臨床試驗的流感疫苗、首個人用植物源疫苗Covifenz，以及兩個在韓國獲批上市的獸用疫苗。
然而，與微生物或動物細胞底盤相比，植物底盤因存在豐富內源蛋白和次級代謝物（如萜類和多酚）而更為復雜。這些成分給重組蛋白純化帶來巨大挑戰，純化成本可占總生產成本80%。前期研究發現，植物源重組蛋白（如流感病毒HA三聚體和SARS-CoV-2 Spike三聚體）在鎳離子親和純化過程中與植物多酚發生強烈相互作用，導致嚴重蛋白聚集，嚴重影響純化效率和產品質量。
多酚與蛋白的相互作用通過共價（不可逆）和非共價（可逆）機制實現。共價結合通常涉及多酚氧化酶（PPO）在氧存在下將多酚氧化為鄰醌，后者與蛋白游離氨基或巰基反應形成不可逆復合物。近期研究在本氏煙中鑒定出6個PPO基因，通過VIGS沉默單個PPO基因可抑制酶促褐變和RBCL交聯，驗證了該假設的可行性。
結果1：關鍵PPO基因的鑒定與功能驗證
通過基因組注釋和轉錄組測序，研究團隊在本氏煙中鑒定出6個候選PPO基因。轉錄組分析顯示4周齡葉片中NbL17g16540（命名為PPOa）表達強烈，而NbL10g18390（PPOb）、NbL06g06640（PPOc）和NbL17g16550（PPOd）雖具有高蛋白序列相似性，但表達水平極低。qRT-PCR分析證實不同葉位PPO基因表達量存在顯著差異，PPOb、PPOc和PPOd的Ct值均高于35。
為探究功能，研究人員設計了兩段300核苷酸的PPOa片段進行VIGS實驗。TRV2::PPOa-1載體與PPOb同源區僅差3個核苷酸，可同時靶向兩個基因；而TRV2::PPOa-2載體存在9個分散差異，對PPOb的沉默效果有限。實驗發現TRV2::PPOa-1而非TRV2::PPOa-2能顯著降低酶促褐變和蛋白聚集，提示PPOa和PPOb共同介導這些效應。
結果2：雙突變體的構建與表征
基于VIGS結果，研究團隊利用CRISPR-Cas9構建了同時敲除PPOa和PPOb的雙突變體（#3和#7系）及多個PPOa單突變體。T3代ppoa;ppob突變體表現出萌發延遲，但第四周后生長與野生型相當，生殖發育無顯著差異。Western blot和考馬斯亮藍染色證實雙突變體內源PPO蛋白完全缺失，單突變體中表達微弱。相應地，野生型提取物酶促褐變明顯，單突變體較輕，雙突變體完全消失。
為評估對重組蛋白純化的影響，研究人員在野生型和ppoa;ppob植株中表達GFP-His蛋白。雖然表達水平相似，但鎳離子親和純化后的SDS-PAGE分析顯示雙突變體中蛋白聚集（標記為高分子復合物HMC）顯著減少，表明消除PPOa和PPOb可通過減輕多酚介導的聚集提高重組蛋白質量。
結果3：病毒蛋白純化效率提升
在本氏煙中表達的重組HA三聚體和S三聚體在純化過程中常形成嚴重聚集。雖然液氮研磨時添加PVPP可吸附部分內源多酚并改善蛋白質量，但該方法因操作復雜不適合大規模生產。本研究在野生型和#3植株中表達純化HAt和St，Western blot顯示目標蛋白表達水平相當，但野生型中持續檢測到HMC聚集。
通過等量葉片組織（1克）的鎳離子親和純化，定量分析顯示#3植株中St產量比野生型提高70%，HAt回收率提高40%。有趣的是，野生型純化的蛋白在SDS-PAGE上呈現更彌散條帶和更高表觀分子量，推測由多酚結合引起。
對未結合樹脂的蛋白組分和不可洗脫組分的分析發現，野生型源HAt在兩者中含量均顯著更高，表明重組蛋白與樹脂相互作用效率低下或不可逆保留。尺寸排阻色譜分析顯示野生型源HAt含有更多HMC。LC-MS鑒定發現野生型HMC中包含581種內源植物蛋白，而#3中僅73種，其中16種為#3特有。肽段強度分析顯示野生型HMC含63.4%內源蛋白和36.6%HAt，而#3中HAt占比達96.8%。
結果4：多酚污染機制解析
為驗證多酚在聚集形成中的作用，研究人員比較了野生型（HA-WT）和#3（HA-#3）植株中純化的HAt蛋白。未浸潤野生型（NT-WT）和#3（NT-#3）作為對照。蛋白結合后，用1M NaOH處理樹脂以剝離結合蛋白或樹脂的多酚。布拉德福德檢測顯示所有NaOH洗脫液均未檢測到蛋白，而多酚檢測顯示HA-WT中多酚含量顯著高于HA-#3，與HMC狀態一致。
質譜分析檢測到多種殘留多酚，包括綠原酸、兒茶素、苯甲酸等，表明蛋白-多酚相互作用無選擇性。其中綠原酸及其結構異構體結合量最大，與其在煙草多酚中的主導地位一致。殘留水平與HMC含量呈正相關，證實植物源重組蛋白在純化過程中存在多酚結合污染。
討論：植物底盤工程的優化路徑
與微生物或哺乳動物平臺不同，本氏煙等植物產生復雜的次級代謝物，特別是多酚，在下游處理過程中干擾蛋白提取。本研究證明這些代謝物被PPOs氧化是驅動純化過程中蛋白聚集的主要因素。通過基因消除PPO活性，明顯減少了蛋白-多酚交聯，提高了重組蛋白的完整性和可回收性。
通過轉錄組分析與VIGS結合，研究人員確定PPOa和PPOb是本氏煙中多酚氧化的主要酶。在此基礎上構建的ppoa;ppob雙敲除突變體在多代中驗證了性能。雖然觀察到早期生長延遲，但成熟植株無顯著發育缺陷，表明敲除系適用于生產規模應用。
值得注意的是，PPOs通過傷口或感染時產生氧化化合物的生化途徑參與植物防御機制。盡管溫室條件下未觀察到ppoa;ppob敲除系對病蟲害敏感性增加，但多酚氧化酶的已知生物學功能提示這些植株在露天環境中可能更脆弱。
與先前研究不同，Western blot分析顯示GFP、HAt和St在野生型和#3系背景下表達水平無顯著差異。這種差異可能源于實驗系統：VIGS對植物生長的高度可變影響可能影響異源蛋白積累。
關鍵的是，雖然表達水平相當，但突變體系純化的蛋白表現出更高回收效率和均一性。然而即使在雙敲除背景下，考馬斯亮藍染色的SDS-PAGE膠上仍可檢測到微量HMC。多酚檢測試劑盒和質譜也檢測到少量多酚。這種殘留存在可能歸因于兩個因素：未氧化多酚可能通過非共價相互作用結合蛋白或鎳離子親和樹脂；雖然PPOa和PPOb是主要貢獻者，但并非唯一涉及的多酚氧化酶。為進一步減少多酚污染，可優化純化條件破壞非共價相互作用，或在ppoa;ppob背景上進一步敲除PPOc和PPOd評估多酚污染能否消除。
方法學創新：多維度驗證技術體系
研究團隊通過多種技術手段驗證實驗結果：構建含三聚化 motifs 的重組基因，采用農桿菌介導的瞬時轉化技術，建立高效的VIGS沉默體系，應用CRISPR-Cas9基因編輯技術構建突變體，結合蛋白質印跡、尺寸排阻色譜、液相色譜-質譜聯用等技術進行多維度分析。特別建立了多酚剝離檢測方法，通過NaOH處理分離結合多酚，結合布拉德福德檢測和多酚含量測定，量化污染程度。質譜分析采用高分辨率液質聯用平臺，建立多酚標準曲線，實現精準定量。這些方法為植物分子農業領域提供了可靠的技術支撐。
