摘要

Huanglongbing（HLB）是一種極具破壞性的疾病，威脅著全球的柑橘種植園。該病與“Candidatus Liberibacter asiaticus”細菌的存在有關(guān)。這種細菌會感染柑橘的韌皮部組織，導(dǎo)致由“callose synthase 7”（CalS7）基因編碼的鈣質(zhì)積累。雖然鈣質(zhì)的積累旨在阻止細菌的傳播，但最終會導(dǎo)致韌皮部堵塞和壞死，從而干擾光合產(chǎn)物的運輸并嚴(yán)重降低產(chǎn)量。為了解決這一問題，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)提供了一種突破性的方法，通過敲除CalS7基因來提高柑橘植物對HLB感染的抵抗力并減輕韌皮部損傷。本研究重點設(shè)計和構(gòu)建了一個基于pDIRECT_21A的CRISPR/Cas9載體，用于針對印度尼西亞柑橘基因型中的CalS7基因進行靶向突變。該載體通過農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）轉(zhuǎn)入胚葉節(jié)中，通過Sanger測序確認(rèn)了突變結(jié)果。通過農(nóng)桿菌進行的遺傳轉(zhuǎn)化成功產(chǎn)生了7株陽性轉(zhuǎn)化體，這些轉(zhuǎn)化體通過Cas9特異性引物進行了PCR驗證。Sanger測序顯示，所有轉(zhuǎn)化體柑橘中的非同義SNP突變均發(fā)生在CalS7基因內(nèi)部，但位于引導(dǎo)RNA（gRNA）序列之外。進一步的研究需要分析這些轉(zhuǎn)化體中CalS7基因的表達情況及其抗性變化，這可能顯著促進柑橘作物的發(fā)展。

引言

Huanglongbing（HLB）是全球柑橘種植者面臨的重要問題之一。在亞洲地區(qū)，該病與一種來自變形菌門（Proteobacteria）α亞群的革蘭氏陰性、無法培養(yǎng)的細菌“Candidatus Liberibacter asiaticus”有關(guān)[1]。這種耐熱病原體通過亞洲柑橘木虱（Diaphorina citri Kuwayama）作為媒介傳播[2]，或者通過將受感染的接穗嫁接到健康的砧木上傳播[3]。在印度尼西亞，該病也被稱為柑橘脈部韌皮部退化（CVPD），首次報道于20世紀(jì)50年代的爪哇島[4]。該病會導(dǎo)致多種癥狀，如植株生長受阻、葉片出現(xiàn)斑駁黃化、葉脈木栓化（有時會被誤認(rèn)為是營養(yǎng)缺乏的癥狀）、果實變小且顏色暗淡、果瓣不對稱以及果實脫落[2],[5],[6]。該病可能導(dǎo)致產(chǎn)量損失30%至100%[7]。 據(jù)認(rèn)為，韌皮部組織中鈣質(zhì)（β-1,3-葡聚糖）的沉積是HLB感染導(dǎo)致柑橘植株受損的主要原因[8],[9]。在病原體感染過程中，鈣質(zhì)的沉積可以阻止細菌向其他組織的擴散，但同時也會阻塞篩管孔隙，從而抑制光合產(chǎn)物向其他植物器官的運輸，進而抑制植株的生長和產(chǎn)量[11]。鈣質(zhì)的生物合成受一組基因的調(diào)控，包括“glucan synthase-like”（GSL）[12]和“callose synthase”（CalS）[13]。在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中已鑒定出12個callose synthase基因，先前的研究[14],[15]表明CalS7基因在韌皮部鈣質(zhì)沉積中起關(guān)鍵作用。一項針對柑橘的研究[16]顯示，在接種后120天和360天時，HLB感染柑橘中的CalS7基因表達顯著增加。 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)有望用于敲除CalS7基因的活性，從而培育出新的抗HLB柑橘品種。該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于柑橘植物，特別是敲除CsLOB1[17],[18],[19]和CsWRKY22[20]基因的活性，這些基因與柑橘潰瘍�。ㄓ蒟anthomonas citri subsp. citri引起）的易感性相關(guān)。此外，還有研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)在 Ponkan 柑橘中敲除CalS7基因[21]，使用的實驗材料為合子和核胚。另一種利用CRISPR/Cas9增強柑橘抗性的方法[22]是敲除ACCELERATED CELL DEATH 2（CsACD2）基因，該基因產(chǎn)生的蛋白質(zhì)與Candidatus Liberibacter asiaticus的SDE15蛋白（CLIBASIA_04025）相互作用，從而抑制植物的免疫系統(tǒng)并增加其易感性[23]。 作為赤道地區(qū)生物多樣性豐富的國家，印度尼西亞擁有許多本地柑橘基因型，包括Keprok柑橘（Citrus reticulata Blanco）和Siam柑橘（Citrus nobilis L.），這些基因型被歸類為HLB易感品種。據(jù)報道，印度尼西亞超過30%的柑橘種植園受到HLB的侵害[24]。然而，通過雜交進行傳統(tǒng)柑橘育種以提高抗性存在諸多挑戰(zhàn)，如無融合生殖和多胚現(xiàn)象、不親和性、不育性、高雜合度以及漫長的幼年期[25],[26]。因此，需要采用CRISPR/Cas9等生物技術(shù)手段來克服這些問題。本研究旨在設(shè)計和構(gòu)建一個基于pDIRECT_21A的CRISPR/Cas9載體，用于印度尼西亞柑橘基因型中的CalS7基因靶向突變。該載體通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入胚葉節(jié)，突變結(jié)果通過Sanger測序得到確認(rèn)。這種方法在印度尼西亞尚未得到廣泛應(yīng)用，但其潛力值得進一步探索，有望為未來的柑橘育種工作帶來幫助。通過CRISPR/Cas9技術(shù)對CalS7基因進行靶向突變，旨在敲除其在HLB感染中的關(guān)鍵作用，從而改善本地柑橘品種的抗性，為其未來的育種計劃提供抗性種質(zhì)資源。

遺傳材料

CRISPR/Cas9-gRNA-CalS7構(gòu)建及克隆過程

在NCBI數(shù)據(jù)庫中查詢CalS7的mRNA序列，對應(yīng)的登錄號為XM_006484852，代表C. sinensis的callose synthase 7類似物（LOC102620841），其轉(zhuǎn)錄本變體X5。使用Citrus基因組數(shù)據(jù)庫進行BLASTn分析后，發(fā)現(xiàn)NCBI中的mRNA序列與orange1.1g022398m位點上的基因具有98.78%的相似度，該基因全長為2,294個堿基對（bp）。

討論

CRISPR/Cas9是一種適用于多種物種的基因編輯工具，特別適用于那些具有高雜合度、無融合生殖或多胚現(xiàn)象的植物，這些特性使得傳統(tǒng)育種方法難以適用。CRISPR/Cas9技術(shù)通過Cas9酶和單導(dǎo)向RNA（sgRNA）兩個主要成分來切割目標(biāo)DNA[44]。因此，sgRNA序列的設(shè)計至關(guān)重要。

結(jié)論