《PLOS One》：Choosing the best route: Comparative optimization of wheat transformation methods for improving yield by targeting TaARE1-D with CRISPR/Cas9
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本研究通過系統優化農桿菌（Agrobacterium）介導的未成熟胚轉化、愈傷組織轉化和注射式原位（in planta）轉化三種方法的參數，將小麥（Triticum aestivum L.）遺傳轉化效率提升至傳統報道（約3%）的十倍以上。核心創新包括縮短未成熟胚的愈傷組織誘導階段，將再生時間減少約一個月，并成功利用CRISPR/Cas9敲除了氮吸收與產量的負調控基因TaARE1-D。獲得的突變體表現出穗粒數、穗長、粒長和千粒重增加，以及與之相關的滯綠表型。優化后的方案為加速基于基因編輯的小麥產量與脅迫耐受性改良提供了穩定平臺。
優化小麥轉化：邁向高產與耐逆育種的新路徑
小麥是全球最重要的主糧作物之一，為世界人口提供了大量的熱量和蛋白質。然而，利用基因編輯技術改良小麥性狀面臨一個主要瓶頸：其遺傳轉化和植株再生效率低下，這極大地限制了CRISPR/Cas9等精準育種工具的應用潛力。為了突破這一限制，本研究對三種主流的農桿菌介導轉化方法——未成熟胚轉化、成熟胚來源愈傷組織轉化以及注射式原位轉化——進行了系統性參數優化，旨在建立高效、快速的轉化與再生平臺，并以高產相關基因TaARE1-D的敲除作為驗證。
核心優化策略與效率突破
研究團隊首先對轉化過程中的多個關鍵參數進行了精細調整，包括農桿菌菌株、細菌密度（OD600）、乙酰丁香酮（acetosyringone）濃度以及共培養條件。在三種測試的菌株（AGL1, EHA105, GV3101）中，攜帶pSOUP輔助質粒的AGL1菌株在所有轉化方法中均表現最佳，這歸因于其與小麥組織更好的相容性和更高效的T-DNA遞送能力。
對于未成熟胚轉化，最優條件確定為使用AGL1菌株，OD600=0.8，接種和共培養培養基中添加150 μM乙酰丁香酮，浸泡時間為15分鐘。在此條件下，轉化后能夠在含潮霉素（hygromycin）的選擇培養基上存活的未成熟胚比例高達66.84%。
對于成熟胚來源的愈傷組織轉化，最佳參數略有不同：同樣使用AGL1菌株，OD600=0.8，但將接種時間縮短至10分鐘，乙酰丁香酮濃度仍為150 μM。此方案實現了55.44%的轉化效率。
關鍵的流程革新體現在對未成熟胚轉化方案的改進。傳統方法需要長達4-6周的愈傷組織誘導和篩選期，而本研究將未成熟胚在含篩選壓力的愈傷組織誘導培養基上僅培養兩周后，便直接轉入添加了0.2 mg/L 吲哚-3-乙酸（IAA）的再生培養基。結果發現，IAA在促進小麥愈傷組織（無論是未成熟胚還是成熟胚來源）再生方面，效果顯著優于1 mg/L的玉米素（zeatin）。這一調整將整個轉化再生流程縮短了約一個月，而轉化效率并未降低。
原位轉化：一條繞過組織培養的快速通道
傳統的轉化方法依賴繁瑣的組織培養。作為一種替代方案，本研究優化了一種注射式原位轉化方法。該方法將農桿菌懸浮液直接注射到小麥幼苗的頂端分生組織，旨在繞過愈傷組織誘導和再生步驟。
通過優化，確定最佳條件為：使用AGL1菌株，OD600=1.0（更高的細菌密度有利于在無富營養條件下實現有效轉化），接種液中含150 μM乙酰丁香酮，注射后將幼苗在黑暗中培養兩天。優化后，通過PCR篩選鑒定的陽性植株比例達到33.33%，相比早期報道的約3%的效率實現了顯著提升。盡管其絕對效率仍低于基于組織培養的方法，但原位轉化以其操作簡便、周期短的優點，為快速獲得編輯植株提供了有前景的替代路徑。
基因編輯驗證：靶向高產負調控因子TaARE1-D
為驗證優化后轉化平臺的有效性，研究選擇了一個已知的高產負調控基因——TaARE1-D 作為靶點。該基因是水稻ARE1基因的小麥同源基因，其功能缺失已被證明能提高氮吸收效率，導致穗長增加、衰老延遲和粒重提升。
利用構建的CRISPR/Cas9載體，通過上述三種優化方法成功獲得了TaARE1-D的敲除突變體。分子檢測表明，所有方法均能產生有效的基因編輯事件，突變類型包括缺失和插入。例如，通過未成熟胚轉化獲得的IM33株系在gRNA1和gRNA2靶點分別發生了8 bp和4 bp的缺失；通過愈傷組織轉化獲得的MC7株系在兩個靶點均發生了2 bp缺失；通過原位轉化獲得的IP5株系在gRNA2靶點發生了1 bp缺失。測序分析證實，這些突變可以穩定遺傳給T1代。
表型分析：編輯植株的產量提升
對代表性突變株系（IM33, MC7, IP5）與非編輯對照品種Kayra進行的表型比較顯示，所有TaARE1-D功能缺失突變體均表現出顯著的產量相關性狀改良：
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穗粒數：從對照的57.5粒顯著增加至63.2-65.0粒。
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穗長：從9.47 cm增加至10.18-10.33 cm。
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粒長：從6.69 mm增加至7.46-7.91 mm。
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千粒重：從40.51 g增加至43.09-43.77 g。
此外，突變體還表現出典型的滯綠表型，即葉片衰老延遲，這與TaARE1-D功能缺失的已知特征一致。這些結果一致表明，通過優化的轉化方法成功敲除TaARE1-D，能夠有效提高小麥的產量潛力。
討論與展望
本研究通過系統性優化，將小麥遺傳轉化效率提升了一個數量級，并顯著縮短了獲得編輯植株的時間。其中，基于組織培養的方法（未成熟胚和愈傷組織轉化）實現了高效率和高再生率，而原位轉化方法則為快速、無需組織培養的基因遞送提供了可行方案。這些優化方案共同構成了加速小麥基因編輯育種的有力工具。
當然，研究也存在局限性，例如所有優化均在單一春小麥品種Kayra上進行，而不同基因型對轉化的響應可能存在差異。因此，未來需要在更多品種，特別是優良栽培種中驗證和調整這些參數。盡管如此，本研究建立的高效轉化框架，結合CRISPR/Cas9精準編輯技術，為快速開發具有更高產量、更好脅迫耐受性的新一代小麥種質資源奠定了堅實的技術基礎，對應對全球糧食安全挑戰具有重要意義。
