《Synthetic and Systems Biotechnology》：Enhanced spinosad production in
Saccharopolyspora spinosa by employing mannose as an extracellular carbon reservoir and optimizing acetyl-CoA supply pathway
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本研究針對多殺菌素工業生產成本高的瓶頸問題，通過紫外誘變獲得高產菌株U7，發現甘露糖替代葡萄糖作為碳源可顯著提升乙酰輔酶A供應。進一步通過CRISPR/Cas9技術敲除競爭途徑基因manB和leuA并過限速酶基因pdhC，使多殺菌素產量達到537.6 mg/L（較野生型提高6.1倍）。該研究為放線菌次級代謝產物生產提供了碳源選擇與代謝通路協同優化的新范式。
在農業生產領域，生物殺蟲劑因其環境友好特性備受關注。其中，由刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）產生的多殺菌素（spinosad）作為一種大環內酯類殺蟲劑，具有高效低毒的特點。然而野生菌株的產量低下導致其工業化生產成本居高不下，這主要源于其復雜的聚酮化合物合成途徑中存在多個代謝瓶頸，特別是關鍵前體乙酰輔酶A（acetyl-CoA）供應不足的問題。
近日發表于《Synthetic and Systems Biotechnology》的研究通過系統性代謝工程策略，成功將多殺菌素產量提升至野生型的6.1倍。該研究創新性地發現甘露糖（mannose）作為碳源可比葡萄糖更高效地促進乙酰輔酶A合成，并通過多組學分析揭示了代謝通路重編程的分子機制。
研究團隊采用紫外誘變（UV mutagenesis）、發酵優化和理性遺傳改造相結合的組合策略。首先通過紫外誘變獲得遺傳穩定性良好的高產突變株U7，其多殺菌素產量達到野生型的2.6倍。通過單因素搖瓶實驗發現，以甘露糖為碳源時突變株的乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A（malonyl-CoA）水平顯著提升。進而利用CRISPR/Cas9基因編輯系統，在U7菌株中同步敲除β-甘露糖苷酶基因（manB）和2-異丙基蘋果酸合酶基因（leuA），并過表達丙酮酸脫氫酶亞基基因（pdhC），構建三重修飾工程菌U7-ΔmanBΔleuA::pdhC。
3.1. 通過紫外誘變增強多殺菌素產量
研究人員通過致死曲線確定50秒為最佳紫外誘變時間，利用微滴培養組學系統篩選獲得高產突變株U7。該菌株不僅多殺菌素產量提高，其生長密度和乙酰輔酶A合成能力也顯著增強，說明誘變引起了廣泛的代謝表型改善。
3.2. 甘露糖作為胞外碳庫促進多殺菌素生物合成
碳源比較實驗表明甘露糖是最適碳源，其能顯著提升乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A水平。轉錄分析顯示甘露糖代謝關鍵基因（manA、pfkA、pyk和pdhA）表達上調，同時發現競爭途徑基因manB和leuA的表達也增強，這為后續代謝工程提供了靶點。
3.3. pdhC和leuA基因表達水平改變對菌株生長和多殺菌素生物合成的影響
功能研究表明，過表達pdhC和敲除leuA能顯著提高乙酰輔酶A供應和多殺菌素產量，同時縮短對棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）的半數致死時間（LT50）。相反，敲除pdhC和過表達leuA則產生抑制作用，驗證了這兩個基因在代謝通量分配中的關鍵作用。
3.4. pdhC、manB和leuA表達組合優化改善多殺菌素生物合成
三重修飾工程菌的生物量提高25.8%，乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A水平顯著提升，最終多殺菌素產量達到537.6 mg/L。時序產量檢測顯示工程菌在整個發酵過程中（除第4天外）均保持較高產素能力。
3.5. pdhC、manB和leuA組合優化促進多殺菌素生產的機制
比較蛋白質組學分析發現，工程菌中1995個蛋白存在差異表達。KEGG富集顯示這些蛋白主要參與氨基酸合成、碳代謝和糖酵解等途徑。具體而言，糖酵解途徑中磷酸烯醇式丙酮酸磷酸轉移酶（PtsI）、果糖二磷酸醛縮酶（FbaA）等關鍵酶表達上調，而磷酸戊糖途徑相關酶表達下調，表明碳流被重定向至乙酰輔酶A合成。此外脂肪酸降解和三羧酸循環（TCA循環）的增強也為多殺菌素合成提供了更多前體和能量。
研究結論強調，通過甘露糖代謝優化與乙酰輔酶A供應通路的協同調控，可實現碳代謝流的高效定向轉化。該研究不僅為多殺菌素工業化生產提供了高產菌株，更重要的是創立了一種適用于放線菌聚酮化合物生產的代謝工程新策略，即通過替代碳源選擇與關鍵節點精細調控的組合方法，解決前體供應不足這一共性難題。這種"碳源-通路"協同優化理念對其它高價值天然產物的生物制造具有重要借鑒意義。
