摘要

背景

微小RNA（miRNA）的準確定量對于早期癌癥檢測至關重要，但由于其長度較短、豐度低以及序列相似度較高，這一任務仍然具有挑戰性。現有的檢測方法往往難以達到足夠的靈敏度、特異性和穩健性，從而無法可靠地應用于臨床實踐。

結果

我們開發了一種名為SPARC的可編程分子診斷平臺，該平臺整合了信號觸發引物交換反應、自供crRNA生成以及分層的PER-轉錄-CRISPR/Cas12a擴增級聯反應。以miRNA-21作為模型，SPARC實現了1.22 fM的超低檢測限，并覆蓋了從1 fM到100 nM的廣泛定量范圍。該系統表現出高特異性、強的分析穩定性和對多種目標（包括miRNA-122）的模塊化適應性。值得注意的是，對致癌miRNA和腫瘤抑制miRNA的雙向分析提高了診斷分辨率。當應用于肝癌細胞系和臨床組織時，SPARC能夠準確區分惡性樣本和正常樣本，并與qRT-PCR測量結果和組織病理學評估結果高度一致。

意義

這種簡化且具有自擴增能力的級聯系統為超靈敏的miRNA檢測提供了一個可擴展、穩健且臨床適用的平臺。SPARC在早期肝細胞癌篩查、分子亞型分類以及更廣泛的精準腫瘤學應用中具有巨大潛力。

引言

肝細胞癌（HCC）是最常見的原發性肝癌類型，其全球發病率和死亡率呈上升趨勢。這一趨勢在乙型肝炎病毒（HBV）高發地區尤為明顯，如亞洲[1]、[2]。HCC的發展主要受慢性病毒感染（如HBV和CV病毒）、肝硬化、長期飲酒以及多種代謝紊亂的影響[3]。HCC管理中的一個關鍵障礙是早期疾病通常無癥狀，導致在中晚期才被診斷出來，此時治愈性治療選擇有限。因此，全球的5年生存率仍低于20%[4]、[5]。目前的診斷策略主要依賴于影像技術和血清學生物標志物[6]、[7]。其中，甲胎蛋白（AFP）是最常用的標志物，但其靈敏度和特異性較低——尤其是在早期或AFP陰性的HCC中——導致頻繁出現假陰性結果。其他候選生物標志物，包括脫γ-羧基凝血酶原（DCP）、AFP-L3、糖蛋白-3（GPC3）、高爾基蛋白73（GP73）和Dickkopf-1（DKK1）也已被研究，但沒有一種能夠提供足夠的診斷準確性以實現可靠的早期檢測[8]、[9]。影像學方法可以提供結構信息，但在識別小病灶方面存在局限性，并且受操作者和設備可用性的影響。這些限制凸顯了對高度敏感、特異且易于獲取的分子標志物的迫切需求。 微小RNA（miRNA）是一類內源性、非編碼的小RNA分子，長度通常在18到24個核苷酸之間，在細胞增殖、分化和凋亡等多種生物過程中發揮關鍵的調節作用。越來越多的證據表明，miRNA在癌癥的發生、進展和轉移中起著重要作用[10]、[11]、[12]、[13]。與傳統基于蛋白質的生物標志物相比，miRNA具有更高的組織特異性、動態響應性和在體液中的穩定性，使其成為HCC診斷的非常有前景的分子候選者[14]。在參與HCC調控的miRNA中，miRNA-21和miRNA-122尤為突出。miRNA-21在HCC和其他惡性腫瘤中經常過表達，促進腫瘤增殖、侵襲和轉移；而miRNA-122在健康肝組織中占miRNA總量的70%以上，在HCC中顯著下調，與不良預后和侵襲性腫瘤進展密切相關[15]、[16]。重要的是，雖然單一標志物的檢測具有有限的診斷準確性，但同時分析上調的致癌miRNA（如miRNA-21）和下調的腫瘤抑制miRNA（如miRNA-122）可以提供更可靠和穩健的診斷方法。這種雙向檢測策略不僅能夠早期和精確地區分惡性與非惡性肝病，還能更準確地分層疾病并進行預后評估。然而，由于miRNA的序列長度較短、表達水平低以及序列同源性高，其檢測在技術上仍然具有挑戰性，這些因素都使得在復雜的生物樣本中實現高靈敏度和特異性變得復雜。傳統的檢測技術，如定量逆轉錄-聚合酶鏈反應（qRT-PCR）、Northern印跡和微陣列分析，雖然具有中等靈敏度和可靠性，但通常需要昂貴的儀器，涉及勞動密集型操作，并且周轉時間較長，從而限制了它們在快速臨床環境中的應用[17]、[18]、[19]、[20]。因此，開發一種高度敏感、特異且臨床可行的miRNA檢測平臺具有重要的科學和轉化意義。 近年來，等溫擴增技術作為核酸檢測領域的焦點受到了越來越多的關注[21]。常用的策略，如滾環擴增（RCA）[22]、[23]、重組酶聚合酶擴增（RPA）[24]、[25]和鏈置換擴增（SDA）[26]，已經顯示出顯著的應用價值。然而，這些方法在檢測短核酸靶標時常常面臨特異性降低和背景噪聲增加的挑戰。為了解決這些問題，研究人員開發了一種新的等溫擴增策略——引物交換反應（PER）[27]、[28]。PER為短核酸提供了一個可編程且結構可控的擴增模塊，從而在生物傳感應用中具有明顯優勢。 在這項研究中，我們開發了一種名為SPARC的可編程分子診斷平臺，該平臺整合了四個功能不同的模塊，這些模塊以高度協調和無縫的方式協同工作，如圖1所示：(I) 信號識別模塊——識別探針（e）與目標miRNA（t）雜交形成t–e雙鏈，從而釋放出催化發夾鏈（CH）并觸發特定的觸發事件；(II) PER擴增模塊——釋放的CH鏈通過Bst DNA聚合酶催化引物交換反應（PER），通過高效的分支遷移產生大量DNA產物；(III) 轉錄模塊——攜帶T7啟動子的PER產物與crRNA模板雜交，并由T7 RNA聚合酶轉錄生成大量功能性crRNA，實現自供的信號放大過程；(IV) 信號輸出模塊——在轉錄的crRNA引導下，Cas12a形成活性Cas12a–crRNA–DNA復合物，非特異性地切割熒光報告探針，產生可測量的熒光信號。通過將這些四個模塊整合到一個統一的多層級聯反應中，SPARC實現了高靈敏度、特異性和可編程的miRNA檢測。以miRNA-21作為模型分析物，該平臺在細胞系和臨床組織樣本中均表現出優異的分析性能，能夠可靠地區分腫瘤組織和正常組織。通過系統的優化和驗證，SPARC建立了一個穩健且多功能的診斷框架，為肝細胞癌（HCC）的早期篩查和精準診斷提供了有力工具。

材料與試劑

所有寡核苷酸均由Sangon Biotech（中國上海）通過高效液相色譜（HPLC）合成并純化，溶解在TE緩沖液（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，pH 8.0）中，并儲存在-20 °C直至進一步使用（表S1）。T7 RNA聚合酶及其相應的10×NE Buffer r2.1購自New England Biolabs（NEB，美國）。TEMED、Bst DNA聚合酶（大片段）和RNase抑制劑購自Beyotime Biotechnology（中國上海）。FQ標記...

生物傳感器設計

miRNA生物傳感平臺的整體設計如圖1所示。為了實現對目標miRNA的高度特異性識別，設計了一種與目標序列互補的識別探針（e）。該探針通過15個核苷酸的互補序列與催化發夾（CH）的莖區雜交。目標miRNA與識別探針完全互補，競爭性地取代探針并觸發發夾結構的有效打開...

結論

總之，我們開發了SPARC，這是一種可編程且模塊化的分子診斷平臺，它將引物交換反應、等溫轉錄和CRISPR/Cas12a介導的信號轉導整合到一個統一的多層擴增級聯反應中。該系統引入了自供crRNA生成機制和級聯擴增策略，共同克服了短核酸檢測的固有挑戰，實現了超靈敏、序列特異性的...

CRediT作者貢獻聲明

Zhenglu Wang：研究。 Haishuo Ji：驗證、數據分析。 Zhe Zeng：研究。 Jingyi Yang：驗證。 Qirui Liu：方法學。 Chao Jia：資源支持。 Lili Zhao：可視化。 Chunlei Zhou：數據分析。 Shujia Chen：驗證。 Wolfgang Knoll：撰寫、審稿與編輯、可視化。 Liyun Zhang：概念構思。 Jia Li：方法學。 Xinying Chang：概念構思。 Cong Han：數據分析。

注釋

作者聲明沒有競爭性財務利益。

資金來源

本研究得到了國家重點研發計劃（項目編號：2020YFA0907300）的支持。作者還感謝深圳市醫學研究基金（項目編號：D2501007）、天津市自然科學基金的一般項目（項目編號：22JCYBJC01230）以及天津市關鍵醫學學科建設項目（項目編號：TJYXZDXK-3-026C和TJYXZDXK-3-019B）的支持。

利益沖突聲明

? 作者聲明沒有已知的競爭性財務利益或個人關系可能影響本文所述的工作。