一種整合了dCas9和iLight9O系統的方案能夠實現對釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中patchoulol生物合成過程的動態調控，從而提高patchoulol的產量
《Bioresource Technology》：A dCas9-integrated iLight9O system enables dynamic regulation for enhanced patchoulol biosynthesis in
Saccharomyces cerevisiae
編輯推薦：
光遺傳學調控技術結合CRISPR/dCas9系統優化了酵母香蘭醇生物合成工藝，通過引入異戊二烯利用雙模塊和動態調控鯊烯合成途徑，顯著提升了產物產量達66%和24%。
李莉|王亞森|王布清|沈立群|高亞輝|林偉|李子杰
中國江蘇省無錫市江南大學生物技術學院，教育部碳水化合物化學與生物技術重點實驗室，郵編214122
摘要
許多生物體已經進化出利用光的能力，這種能力通過光感受蛋白來介導多種生物過程。目前，幾種光遺傳傳感器系統被廣泛用于酵母中。然而，當這些系統被用于基因抑制以調節酵母的內源基因表達時，通常需要在目標基因的天然啟動子附近插入相應的靶位點以實現精確調控。為了解決這些限制，開發了一種新型的藍光誘導光遺傳工具iLight9，這是一種與CRISPR-dCas9平臺集成的一組分光遺傳生物傳感器。通過添加蛋白質降解標簽，進一步增強了iLight9系統的穩定性。由此產生的系統被稱為iLight9O，它可以通過引入特定的sgRNA來程序化地調節不同的基因。隨后，采用系統的代謝工程策略在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中構建了一個高效的 patchoulol 生產細胞工廠。此外，將兩步異戊二烯利用（IU）途徑引入重組菌株中，以提高其 patchoulol 的生物合成能力。關鍵的是，iLight9O 系統被用來動態下調角鯊烯合酶（squalene synthase）的活性，這是一種在競爭性角鯊烯生物合成途徑中的關鍵酶。這種光遺傳通量控制策略使 IU 優化菌株中的 patchoulol 含量增加了 66%，MVAIU2 菌株中的 patchoulol 含量增加了 24%，顯示出比靜態工程方法顯著的優勢。
引言
光遺傳系統能夠利用光作為誘導刺激來精確控制基因表達（Pérez 等，2022）。作為強大的基因調控工具，它們具有高誘導性、劑量依賴性響應性和成本效益。此外，由于光是唯一的調控輸入，光遺傳控制與多種培養基具有廣泛的兼容性（Benisch 等，2024）。另外，光作為一種經濟的誘導劑，允許靈活調整光照強度和持續時間。這些固有的優勢有助于微生物質框架開發的精細調節，并提高工藝的可擴展性，從而使光遺傳策略在工業應用中具有很高的前景。藍光是一種短波長刺激，具有易于控制、無需物理分離和對細胞無侵入性的特點，使其成為生物技術應用的理想誘導信號（Wang 等，2022；Xu 等，2018）。
釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是生物技術領域中最相關和多用途的微生物之一（Lian 等，2018）。其基因組中缺乏內源性光感受基因，這使得可以在該生物框架中實現多種光遺傳開關，從而實現對多個細胞過程的正交光學控制（Pérez 等，2022）。對于釀酒酵母中的轉錄抑制，傳統的光遺傳系統通常需要在目標基因上游插入特定的調控序列以實現光誘導控制。這種方法耗時較長，尤其是在協調多個基因時，而且反復的基因組修飾可能會對宿主細胞的適應性產生不利影響。相比之下，CRISPR 干擾（CRISPRi）系統只需要設計序列特異性的引導 RNA（sgRNAs）即可實現對多個目標基因的可調諧抑制（Presnell 等，2022），從而有效規避了這些限制。因此，有必要在釀酒酵母中開發一個將光學組件與 CRISPRi 系統整合的基因調控平臺。
Patchoulol 是一種倍半萜醇，由于其獨特且持久的香氣，被廣泛用于護膚品和香水等產品中（Lee, Lee 等，2020；van Beek 和 Joulain，2018）。此外，它在制藥應用中也顯示出巨大的潛力，具有神經保護、抗炎、抗癌和鎮痛活性。它還是化療藥物紫杉醇（paclitaxel）合成的前體（Silva-Filho 等，2016）。傳統上，patchoulol 主要通過植物提取獲得，這具有生產周期長、產量低和成本高的特點（Swamy 和 Sinniah，2016；Zhan 等，2014）。近年來，微生物生產作為一種可持續的替代方案受到了越來越多的關注。因此，包括 patchoulol 在內的多種高價值萜類化合物已通過異源表達在工程化的微生物細胞工廠中成功生產（Aguilar 等，2020；Ma 等，2019；Peng 等，2023）。釀酒酵母因其高安全性、遺傳特性明確、葡萄糖利用效率高和生長速度快而被廣泛用于萜類化合物的合成（Kong 等，2023；Q. Mo 等，2022）。值得注意的是，釀酒酵母具有內源性的甲瓦龍酸（MVA）途徑，可以生物合成法尼基焦磷酸（FPP）。作為 patchoulol 合成的直接前體，FPP 可以通過外源 patchoulol 合酶（PTS）的催化轉化為 patchoulol（Paramasivan 和 Mutturi，2017；Vickers 等，2017）。此前，已經在釀酒酵母中成功構建了一個用于生產 patchoulol 的合成細胞工廠（Asadollahi 等，2007）。隨后，patchoulol 的生物合成途徑得到了進一步優化，顯著提高了 patchoulol 的產量（Tao 等，2024）。
在這項研究中，我們基于 VVD 蛋白開發了一個光敏系統，并創新地將其與 CRISPR/dCas9 系統結合，構建了 iLight9。為了解決泄漏表達的問題并提高整體穩定性，我們采取了包括在光敏蛋白和結合蛋白之間加入連接子（2T1）以及在 dCas9 中融合蛋白質降解標簽（SULI）等策略。這導致了改進后的版本 iLight9O 系統的誕生。基于釀酒酵母的內源 MVA 途徑，通過系統的代謝工程構建了一個高效的 patchoulol 生產細胞工廠。為了簡化生物合成途徑并提高產量，引入了兩步異戊二烯利用（IU）模塊。角鯊烯是釀酒酵母中膜生物發生的關鍵前體。角鯊烯的生物合成途徑與 patchoulol 的合成途徑存在競爭。通過 iLight9O 系統動態調節角鯊烯的代謝通量，顯著提高了 patchoulol 的產量，同時保持了細胞的強勁生長和生理適應性。
試劑、質粒和菌株
PrimeSTAR GXL DNA 聚合酶是從 TaKaRa（日本大津）購買的。質粒提取、DNA 凝膠純化和 PCR 產物純化試劑盒是從 TransGen Biotech（中國北京）購買的。patchoulol 和角鯊烯的純標準品是從 Aladdin（中國上海）獲得的。本研究中構建的所有質粒列在表 S1 中。同源重組酶是從 ABclonal（中國蘇州）購買的。引物的合成以及...
單組分光遺傳傳感器系統的開發、優化和驗證
來自 Neurospora crassa 的 VVD 蛋白在藍光照射下能夠形成同二聚體（Chen 等，2016）。基于這一特性，開發了 LightOn 系統，以實現哺乳動物細胞和小鼠中目標基因轉錄的快速誘導（Wang 等，2012）。此外，yLightOn 系統進一步被改造用于酵母細胞中的光遺傳控制（Xu 等，2018）。在這項研究中，yLightOn 系統被修改以增強其...
結論
在這項研究中，通過將藍光響應的單組分傳感器與 dCas9 系統集成，開發了一種新型的光遺傳工具 iLight9。此外，通過優化 dCas9 降解融合標簽，創建了更先進的 iLight9O 系統。該工具通過結合藍光誘導和 sgRNA 導向的目標定位，在釀酒酵母（S. cerevisiae）中實現了快速、可逆和可編程的基因調控。此外，在釀酒酵母中構建了一個高效的 patchoulol 生產細胞工廠...
CRediT 作者貢獻聲明
李莉：撰寫——原始草稿、方法學、研究、形式分析、概念化。
王亞森：方法學、研究。
王布清：方法學。
沈立群：研究。
高亞輝：形式分析。
林偉：監督。
李子杰：撰寫——審稿與編輯、撰寫——原始草稿、監督、資金獲取、概念化。
利益沖突聲明
作者聲明他們沒有已知的競爭性財務利益或個人關系可能影響本文所述的工作。
致謝
本工作得到了中國國家重點研發計劃（2025YFF1107300）和國家自然科學基金（32171475）的支持。
