《Bioresource Technology》：Engineering stress tolerance in
Saccharomyces cerevisiae by overexpressing
PIR3 and
SPI1 for efficient ethanol production from high-concentration sugarcane molasses
編輯推薦：
通過多組學分析和CRISPR基因編輯，揭示了高濃度甘蔗糖蜜中鉀鈣離子共存的脅迫機制，鑒定出PIR3、SPI1、AQR1和GUT2四個關鍵基因，其中PIR3和SPI1維持細胞完整性，AQR1和GUT2調控代謝通量，工程菌株乙醇產量提升24.6%，同時肉桂酸合成增加12.5%。
魏陽王|廖蓓|鄭萍|黃明月|魏宇拓|牛福星
廣西科技大學糖資源綠色加工重點實驗室，中國柳州545006
摘要
鉀離子和鈣離子的共存已被確定為限制高濃度甘蔗糖蜜中Saccharomyces cerevisiae高產乙醇發酵的主要因素。為了識別賦予這種壓力耐受性的關鍵基因，我們采用了一種綜合策略，結合了多組學分析、CRISPR介導的基因激活/抑制和靶向過表達。這種方法確定了四個關鍵基因：PIR3、SPI1、AQR1和GUT2。功能分析表明，AQR1和GUT2主要通過重新定向代謝流來增強乙醇生物合成，而PIR3和SPI1對于在壓力下維持細胞完整性和活力至關重要。在野生型菌株中過表達PIR3和SPI1使乙醇產量增加了24.6%，在5升發酵罐中的最終濃度達到了113.3克/升，這一表現與強健的工業菌株相當。此外，這種工程策略還提高了其他有價值化合物的合成，例如肉桂酸的產量增加了12.5%。因此，我們的工作確定了用于工程化耐壓酵母的精確遺傳靶點，并為高濃度甘蔗糖蜜的高效生物轉化奠定了基礎。
引言
化石燃料的日益枯竭和日益嚴重的環境問題迫使全球轉向可持續能源替代品。作為可再生且碳中性的能源，生物乙醇在減少溫室氣體排放和降低對不可再生資源的依賴方面發揮著關鍵作用（Wang等人，2024年）。為了滿足對可持續能源不斷增長的需求，第二代生物乙醇技術因其利用非食品生物質（如稻草（Sukma等人，2024年）、甘蔗渣（Ojo-Kupoluyi等人，2024年）和其他纖維素材料，以及工業廢棄物（如糖蜜（Parascanu等人，2021年）而受到廣泛關注。這種方法使得綠色生物制造與成本效益高的生物乙醇生產相結合，從而促進了良好的生物經濟價值，并有助于環境可持續性（Afedzi等人，2025年）。
在各種原料中，甘蔗糖蜜因其經濟和生態優勢而成為生物乙醇生產的有前景的原料。作為糖精煉的副產品，糖蜜富含可發酵糖（蔗糖、葡萄糖和果糖），提供了一種成本效益高且可再生的資源，避免與糧食作物競爭（Lino等人，2018年；Raghavi等人，2016年）。其利用符合循環經濟原則，通過利用工業廢棄物來減少與處置相關的環境負擔。此外，由糖蜜衍生的乙醇生產減少了土地使用沖突，解決了與第一代來自可食用作物的生物燃料相關的倫理問題。盡管有這些優勢，但利用甘蔗糖蜜生產乙醇仍面臨若干技術和生物學挑戰。糖蜜復雜的組成，包括重金屬、酚類化合物和過量鹽等非糖雜質，會抑制酵母代謝并降低發酵效率（Lino等人，2018年；Wang等人，2024年）。高糖濃度可能會對Saccharomyces cerevisiae造成滲透壓應力，影響細胞活力和乙醇產量。此外，由于甘蔗品種和加工條件的不同，糖蜜質量不穩定，使得工藝標準化變得復雜。當前的發酵系統還面臨副產物積累的問題（例如甘油和有機酸），這會將碳流從乙醇合成中分流出去。要克服這些限制，需要在菌株工程、預處理優化和過程控制方面采取創新策略，以提高基于糖蜜的生物乙醇生產的經濟可行性。
要從高濃度甘蔗糖蜜（HCSM）中實現高效的乙醇發酵，需要克服其主要抑制性壓力因素。先前的研究已經證明，K+和Ca2+的共存是限制S. cerevisiae在糖蜜中高效合成乙醇的主要因素，這些研究采用了ARTP誘變、適應性進化、高通量篩選和組學分析的綜合方法（Wang等人，2024年）。為了識別調控這種細胞反應的具體遺傳介質，并確定哪些基因控制關鍵的表型結果，我們進行了全面的遺傳篩選，結合了跨組學分析、CRISPR基因編輯（激活和抑制）以及單基因/多基因表達。本研究首次識別并驗證了一組新基因，尤其是PIR3和SPI1，它們是K+和Ca2+壓力下細胞形態的關鍵調節因子，從而為之前觀察到的現象提供了機制上的理解。
章節片段
菌株、質粒和引物
本研究中使用的S. cerevisiae菌株和質粒總結在表S1中。本研究中使用的引物總結在表S2中。質粒的構建
本研究中使用的所有質粒列在表S1中。關鍵質粒包括CRISPR-VPR載體（pRS415-Cas9-VPR-NrsR和pRS423-TyrSgH-KanMX）和基因過表達載體（Yep352-KanMX），均使用無縫組裝克隆技術構建（Uniclone One Step Seamless Cloning Kit，Genesand，中國）。肉桂酸生物合成質粒
突變基因的篩選
基于K+和Ca2+共存是HCSM發酵中的關鍵壓力因素的發現（Wang等人，2024年），我們試圖識別這種反應的遺傳介質。與野生型菌株 GJ08在相同的發酵條件下相比， NGTM-F1表現出1920個差異表達基因（DEGs），其中包括795個上調基因和1125個下調基因（圖S1）。同樣， NGK+&Ca2+-F1顯示了215個DEGs，其中77個上調基因和138個下調基因結論
本研究確定了PIR3、SPI1、AQR1和GUT2作為工程化Saccharomyces cerevisiae耐受性和提高高濃度甘蔗糖蜜乙醇產量的關鍵遺傳靶點。過表達與細胞壁相關的基因PIR3和SPI1賦予了強大的耐壓性，而抑制代謝調節因子AQR1和GUT2則將碳流重新導向乙醇合成。這一策略不僅使乙醇產量在擴大規模發酵中增加了24.6%
CRediT作者貢獻聲明
魏陽王：撰寫 – 審稿與編輯，撰寫 – 原稿，可視化，研究，數據管理。廖蓓：可視化，研究。鄭萍：可視化，研究。黃明月：撰寫 – 審稿與編輯。魏宇拓：撰寫 – 審稿與編輯，研究，資金獲取，概念構思。牛福星：撰寫 – 審稿與編輯，撰寫 – 原稿，研究，資金獲取，概念構思。
利益沖突聲明
作者聲明他們沒有已知的可能會影響本文所述工作的競爭性財務利益或個人關系。
致謝
我們衷心感謝浙江大學的連家昌教授慷慨提供CRISPR-VPR系統，以及廣東中醫藥大學的王奎教授友好地貢獻了pRS42H-Cas9-NAT系統。他們的智慧貢獻和物質支持對這項研究的技術實施至關重要。
本研究得到了國家自然科學基金（批準號：32260246）和廣西科技大學博士基金的資助
