尿路感染（UTIs）是由病原菌侵入泌尿系統（包括尿道、膀胱、輸尿管和腎臟）引起的炎癥性疾病，是全球最常見的傳染病之一（Mancuso等人，2023年）。尿路感染的典型癥狀包括發熱、尿頻、尿急和排尿疼痛，嚴重病例可能發展為腎盂腎炎、尿毒癥、菌血癥甚至死亡（Flores-Mireles等人，2015年）。據統計，全球每年有超過1.5億人患有尿路感染，女性的終生患病風險高達50%-60%（Foxman，2014年；Klein和Hultgren，2020年）。尿路感染占所有感染的近25%，復發率高達44%（Foxman，2003年；Ik?helmo等人，1996年；Suskind等人，2016年）。更嚴重的是，尿路感染已成為抗生素濫用的一個“災難區”。研究表明，不必要地使用廣譜抗生素是導致抗菌素耐藥性（AMR）流行的主要因素（Murray等人，2022年；Von Vietinghoff等人，2024年）。這直接促進了“超級細菌”的傳播，如產生擴展譜β-內酰胺酶（ESBL）的大腸桿菌（E. coli）、耐萬古霉素的腸球菌以及耐碳青霉烯的腸桿菌科（CRE），每年在醫療保健上造成數十億美元的損失（Magill等人，2014年；McCann等人，2020年）。

傳統觀點認為革蘭氏陰性細菌是尿路感染的主要病原體，僅大腸桿菌就占社區和醫院環境中病例的70%至95%（Foxman，2010年；Griebling，2005年；Hooton，2012年）。然而，最近的幾項臨床研究指出尿路感染病原體分布正在發生變化。在復雜性尿路感染（cUTIs）、醫院感染和免疫抑制患者中，糞腸球菌（E. faecalis）等革蘭氏陽性細菌的檢出率顯著增加至20%（Codelia-Anjum等人，2023年；Salm等人，2023年）。面對尿路感染細菌多樣性增加和抗菌素耐藥性加速演變的雙重挑戰，早期和準確的病原體檢測對于精確的臨床治療和限制廣譜抗生素的濫用至關重要。

病原體檢測技術主要包括細菌培養和分子生物學檢測方法，如聚合酶鏈反應（PCR）（Kelly，2023年；Marcus等人，2012年；Schmiemann等人，2010年）。盡管細菌培養的成本較低且標準化程度較高，但其缺點是檢測過程相對較長（18小時至30小時），需要專業技術人員，并且可能受到抗生素治療的影響，導致結果不準確。近年來，基于PCR的分子診斷技術已被廣泛用于檢測血液和尿液等臨床樣本中的病原體（Gosiewski等人，2014年；Wojno等人，2020年）。然而，PCR技術存在固有的局限性，包括依賴熱循環儀進行精確溫度控制、需要專用設備和訓練有素的人員，以及容易受到復雜臨床基質中擴增抑制劑的影響（例如尿液中的尿素或血液中的肝素）。CRISPR-Cas系統的出現通過利用CRISPR核酸酶（如Cas12a/Cas13a）的可編程切割活性徹底改變了分子診斷方法，提供了兩種不同的模式：（1）無擴增的CRISPR檢測利用高活性Cas酶直接切割微量核酸，檢測時間快（<30分鐘），但通常靈敏度有限（Fozouni等人，2021年；Li等人，2023a；Li等人，2023b）；（2）擴增耦合的CRISPR診斷結合了等溫擴增技術（如重組酶聚合酶擴增（RPA）和環介導的等溫擴增（LAMP）與CRISPR介導的輔助切割，實現了超高的靈敏度（aM水平）、室溫操作和多重檢測能力，從而開創了下一代即時檢測平臺，克服了傳統方法的限制（Broughton等人，2020年；Ding等人，2020年；Wang等人，2024年）。

然而，尿路感染中細菌DNA檢測仍存在一些問題需要解決：（1）在某些尿路感染中，細菌載量不足以直接檢測，需要離心濃縮微生物生物量以獲得足夠的DNA產量。然而，尿液中含有許多容易結晶并抑制細菌DNA檢測的物質，如草酸鈣、尿酸、無定形磷酸鹽和尿酸鹽。這些結晶在離心過程中會形成大顆粒沉積物，嚴重影響細菌核酸檢測的準確性（Staley等人，2019年）；（2）革蘭氏陽性細菌的多層肽聚糖細胞壁結構對酶解和化學裂解具有很強的抵抗力。傳統的商業細菌DNA提取試劑盒需要長時間的酶預處理（≥30分鐘）使用溶菌酶部分降解肽聚糖，然后還需額外步驟去除殘留的酶成分以避免干擾檢測（Ye和Lei，2023年）。雖然機械裂解可以提高DNA產量，但DNA容易斷裂成短片段，并可能在處理過程中增加氣溶膠污染的風險（Chiu和Miller，2019年）。因此，開發一種無需離心、廣譜裂解且不依賴純化的核酸提取平臺對于克服阻礙革蘭氏陰性和陽性病原體同時檢測的技術限制至關重要，從而推進下一代尿路感染分子診斷框架的發展。

近年來，功能化納米材料為高效病原體富集提供了新的策略（Elhariry等人，2025年）。由于其超順磁性特性和可修飾的表面，磁納米顆粒（MNPs）已被廣泛用于細菌分離和富集（Plouffe等人，2015年；Wang等人，2020年）。然而，傳統的基于MNPs的方案需要額外的切割步驟來釋放目標核酸，這可能會引入干擾進一步檢測的抑制劑（Shan等人，2010年；Usvaliev等人，2023年）。

在這項研究中，我們設計了具有超順磁性Fe₃O₄核心的Au殼/Au衛星復合等離子體磁納米顆粒（PMNPs），用于快速分離和細菌DNA提取。外層Au殼/Au衛星結構具有雙重功能：（1）表面修飾有廣譜細菌識別元件4-巰基苯甲酸（4-MPBA），可以在尿液樣本中同時捕獲所有革蘭氏陽性和陰性細菌；（2）在近紅外光（NIR）激發下產生局部表面等離子體共振（LSPR）效應，在金納米材料/細菌復合物富集后放大這一效應，實現原位光熱裂解細菌，同時釋放DNA并避免化學裂解試劑的干擾，為后續檢測提供高濃度的模板。為了實現超靈敏和快速的核酸檢測，我們將重組酶聚合酶擴增（RPA）與CRISPR-Cas系統結合，構建了一個一步RPA-CRISPR/Cas12a-Cas13a診斷系統，用于尿路感染中大腸桿菌和糞腸球菌的雙重檢測。該平臺結合了磁富集、光熱裂解和RPA-CRISPR技術，建立了一個集成平臺（稱為ME-CRISPR），實現了大腸桿菌和糞腸球菌在40分鐘內的超靈敏檢測，檢測限（LOD）低至10 CFU/mL。90個臨床樣本（包括39個大腸桿菌樣本、26個糞腸球菌樣本和25個陰性樣本）的結果驗證了該方法的可行性。與qPCR相比，其敏感性和特異性均為100%。這項工作有三個關鍵創新點：首先，PMNPs-MPBA設計用于無需離心的廣譜細菌捕獲和不受革蘭氏類型影響的廣譜光熱裂解，從而解決了傳統樣本處理的主要限制；其次，建立了一步雙鏈RPA-CRISPR/Cas12a-Cas13a檢測方法，通過正交CRISPR系統在25分鐘內同時特異性檢測這兩種病原體；第三，這些模塊被完全整合到一個快速（40分鐘）、超靈敏（10 CFU/mL）的工作流程中，消除了單獨的DNA提取和熱循環步驟。總體而言，ME-CRISPR平臺為尿路感染的即時診斷提供了一種變革性的集成策略。