《Food Bioscience》：Combining toehold-mediated strand displacement reaction and CRISPR/Cas12a for ultrasensitive fluorescent aptasensing of aflatoxin B1
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黃曲霉毒素B1（AFB1）污染嚴重威脅食品安全，本研究通過集成等溫DNA擴增與CRISPR/Cas12a系統構建了一種級聯信號放大熒光傳感平臺，實現AFB1的痕量檢測（檢測限0.062 pg/mL），并展現出86.7%-103.9%的高回收率。該平臺利用AFB1與aptamer結合后觸發TSDR循環擴增，結合Cas12a的轉錄切割活性實現熒光信號放大，有效解決了復雜食品基質中的檢測難題。
吳志輝|秦芳澤|馬宇聰|嚴正宇|李向志|蒲洪斌|劉世剛
湖南省食品科學與生物技術重點實驗室，湖南農業大學食品科學與技術學院，長沙410128，中國
摘要
黃曲霉毒素B1（AFB1）在農產品中的污染嚴重威脅食品安全。本文構建了一種級聯信號放大的熒光適配體傳感器，通過將等溫DNA擴增與CRISPR/Cas12a系統結合，實現AFB1的超靈敏檢測。具體而言，當AFB1與其適配體特異性結合時，適配體的互補DNA（cDNA）通過與可編程探針雜交，觸發動態趾抓介導的鏈置換反應（TSDR）。TSDR策略成功實現了cDNA的循環利用并生成多個雙鏈DNA（dsDNA）產物。隨后，dsDNA激活Cas12a的切割活性，切割熒光標記的單鏈DNA報告分子，產生顯著增強的熒光信號。因此，建立了一種AFB1檢測的熒光開啟方法。該適配體傳感器能夠準確定量檢測AFB1，檢測限為0.062 pg/mL，在AFB1添加的食品樣本中顯示出86.7%-103.9%的優良回收率。TSDR與CRISPR/Cas12a的創新結合，為復雜食品基質中的AFB1檢測提供了一個低背景、高靈敏度和準確的傳感平臺。這項工作還為擴展CRISPR/Cas生物傳感器在小分子檢測中的應用提供了新的思路。
引言
黃曲霉毒素B1（AFB1）是由黃曲霉和寄生曲霉產生的強致癌次級代謝物，廣泛污染玉米和花生等農產品（Dong等人，2025年）。AFB1具有較高的熱穩定性，長期攝入可能導致肝癌和免疫抑制等嚴重健康風險（Frangiamone等人，2024年；Lu等人，2025年）。因此，建立高效準確的AFB1檢測方法對于確保食品安全具有重要意義。目前，盡管色譜法和免疫測定等傳統技術非常可靠，但它們依賴于大型儀器和專業知識操作（Khayoon等人，2012年；Zhao等人，2024年），難以滿足快速靈敏檢測的需求。因此，開發具有高靈敏度、便捷性和可靠性的新AFB1檢測策略非常重要。
近年來，成簇規律間隔短回文重復序列（CRISPR）和CRISPR相關（Cas）核酸酶系統已成為生物傳感領域的強大工具（Lee等人，2024年；Xu等人，2025年）。CRISPR/Cas系統通過Cas核酸酶實現高效的RNA引導的核酸切割。特別是CRISPR/Cas12a系統通過CRISPR RNA（crRNA）與互補目標序列之間的堿基配對，能夠通過單鏈DNA（ssDNA）的切割產生酶催化的信號放大。由于小分子缺乏天然的核酸靶標，通過適配體將其濃度信息轉化為CRISPR可識別的核酸信號是一個可行的解決方案（Xiong等人，2020年）。例如，Ma等人開發了一種基于雜交鏈反應（HCR）和Cas12a切割活性的新型適配體傳感策略，用于高靈敏度檢測三磷酸腺苷（ATP）（Ma等人，2023年），該檢測系統通過兩階段信號轉換和放大機制實現了1.0 nmol/L的檢測限（LOD），整個檢測過程在100分鐘內完成。Hu等人報道了一種基于空間阻斷分裂CRISPR-Cas12a系統的新型檢測平臺，用于超靈敏檢測谷胱甘肽，檢測限為20 pmol/L（Hu等人，2025年）。這種策略結合了高靈敏度和低背景干擾的小分子檢測新方法。因此，CRISPR/Cas12a系統在開發用于小分子檢測的適配體方面具有巨大潛力（Sen等人，2024年；Zhang等人，2024年）。
近年來，研究人員探索了多種等溫DNA擴增技術（Singh等人，2023年）。趾抓介導的鏈置換反應（TSDR）是一種無酶的等溫擴增技術，具有高擴增效率和低背景信號等優點（Xu等人，2024年；Yu等人，2024年）。TSDR是一種DNA互補雜交過程，其中入侵的DNA鏈通過暴露的單鏈結構（稱為趾抓）置換雙鏈DNA（dsDNA）中的短鏈，生成新的dsDNA產物（Liu等人，2024年；Zhou等人，2021年）。與其他等溫DNA擴增方法（如HCR（Zhu等人，2024年）或催化發夾組裝（CHA）（Zeng等人，2022年）相比，TSDR通過精確設計的DNA序列實現目標的循環擴增，顯著提高了信號放大效率，同時避免了復雜序列設計和過量DNA消耗的挑戰（Song等人，2024年）。此外，通過調整短DNA鏈的長度和組成，可以精確調節TSDR的動力學特性，為構建高效可控的生物傳感系統提供了新的可能性。
在本研究中，我們創新性地構建了一種基于TSDR和CRISPR/Cas12a系統組合的超靈敏AFB1適配體傳感器，實現級聯信號放大（圖1）。該平臺通過合理設計具有末端趾抓結構的A1/A2雙鏈探針開發而成。在AFB1存在的情況下，AFB1與適配體結合，互補DNA（cDNA）觸發高效的TSDR反應。隨后引入燃料鏈（F）以實現cDNA的循環利用，最終生成大量含有原間隔序列（PAM）的A1/F dsDNA產物。這些產物有效激活Cas12a的切割活性，產生顯著的熒光信號。因此，通過結合TSDR的高效循環擴增能力和CRISPR/Cas12a系統的催化放大優勢，成功獲得了超靈敏的AFB1傳感平臺。這項工作建立了一種新型傳感方法，具有廣泛的應用前景，可用于食品產品中微量小分子污染物的靈敏檢測。
部分摘錄
化學物質和材料
Lachnospiraceae菌株Cas12a（LbCas12a，cpf1）購自Tolo Biotechnology Co., Ltd.（中國上海）。反應緩沖液A（40 mmol/L HEPES，100 mmol/L NaCl，20 mmol/L MgCl2，pH 7.4）由北京Nobel Ryder Technology Co., Ltd.（中國北京）提供。所有核酸序列、DNA標記物（25-50 bp）、4S GelRed核酸染料和DEPC處理的無核酸酶水由Sangon Biotech Co., Ltd.（中國上海）提供。天然聚丙烯酰胺凝膠（15%）用于電泳
檢測原理
基于TSDR-CRISPR/Cas12a級聯信號放大的熒光適配體傳感器示意圖如圖1所示。提取后（圖1A），AFB1優先特異性結合到適配體上，隨后加入的cDNA與未結合的適配體互補配對（圖1B）。剩余的cDNA與預先設計的A1/A2雙鏈結構相互作用，通過趾抓1有效置換A2鏈，形成A1/cDNA雙鏈結構。引入的燃料鏈F隨后通過趾抓與A1鏈結合
結論
總之，成功開發了一種結合等溫DNA擴增和CRISPR/Cas的熒光適配體傳感器，實現了AFB1的低背景、高靈敏度和高特異性檢測。該適配體的AFB1檢測限為0.062 pg/mL。此外，在包括花生、玉米和杏仁在內的復雜基質中，使用該傳感器檢測AFB1時顯示出86.7%-103.9%的優良回收率。此外，其檢測結果與商業膠體金基方法高度一致
CRediT作者貢獻聲明
李向志：方法學、正式分析。嚴正宇：正式分析。馬宇聰：資源、正式分析。秦芳澤：資源、正式分析。吳志輝：撰寫——原始草稿、驗證、方法學、資金獲取、數據管理。劉世剛：撰寫——審稿與編輯、監督、概念化。蒲洪斌：方法學、概念化利益沖突聲明
作者聲明他們沒有已知的可能會影響本文工作的競爭性財務利益或個人關系。
利益沖突聲明
? 作者聲明他們沒有已知的可能會影響本文工作的競爭性財務利益或個人關系。
致謝
作者感謝湖南省自然科學基金（2024JJ6237）、湖南省教育廳的科學研究基金（24B0202）以及國家自然科學基金（32102074）的財政支持。
