《ACS Sensors》：Synthetic DNA Transducers Integrate DNA Repair to CRISPR Signal Transduction
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本文報道了一種創新的合成DNA傳感器平臺，通過將堿基切除修復（BER）酶活性與CRISPR-Cas12a信號放大系統直接偶聯，實現了對DNA糖基化酶（如UDG、hOGG1）活性的高靈敏度、單步檢測。該平臺利用DNA發夾結構的設計，僅在酶修復后激活Cas12a的反式切割活性，為DNA修復活性監測及抑制劑高通量篩選提供了通用框架。
合成DNA傳感器整合DNA修復與CRISPR信號轉導
引言
CRISPR分子診斷技術已徹底改變核酸檢測領域，然而將上游酶活性整合至可編程CRISPR輸出仍鮮有探索。本研究提出一種合成轉導平臺，直接將內源性DNA修復活性與CRISPR-Cas12a激活相耦合。通過將堿基切除修復（BER）事件與可編程DNA傳感器的結構轉換相鏈接，成功將DNA糖基化酶（如尿嘧啶DNA糖基化酶UDG和人類8-氧鳥嘌呤糖基化酶hOGG1）的活性轉化為通過Cas12a介導的旁側切割產生的熒光信號。這一單步檢測法能夠快速、靈敏且高特異性地基于裂解液檢測修復活性，并可輕松適配用于小分子抑制劑的高通量篩選。其模塊化設計支持適配多種糖基化酶活性，為將DNA修復活性轉導為可編程CRISPR輸出建立了通用框架。
結果與討論
合成DNA傳感器實現DNA修復激活的CRISPR信號轉導
研究團隊合理設計了一組合成DNA分子傳感器，該傳感器可被編程為僅在特定修復活性發生后激活CRISPR-Cas12a系統。該DNA傳感器具備三個關鍵特征：首先，它是一種合成DNA發夾結構，其序列中含有一個或多個受損核苷酸；其次，它能被特定的DNA修復酶識別為其天然酶底物；第三，其設計使其能夠呈現兩種不同的構象狀態，即在修復活性發生前，它處于Cas12a非活性的發夾結構，僅在修復活性發生后才轉換為Cas12a活性的構象。該設計利用了修復活性引起的發夾結構不穩定性，從而有效調控Cas12a核糖核蛋白（RNP）的結合與活性。
UDG響應型DNA傳感器的設計與Cas12a活性調控
作為概念驗證，研究團隊設計了針對尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）敏感的DNA傳感器，用于下游調控CRISPR-Cas12a系統。UDG能特異性識別并切除DNA中的尿嘧啶堿基，通過水解N-糖苷鍵生成脫堿基（AP）位點，從而啟動BER通路。研究人員設計了一系列UDG傳感器，在其非靶鏈（NTS）的發夾莖部區域嵌入了不同數量的尿嘧啶損傷。實驗結果表明，含有尿嘧啶損傷的UDG傳感器可作為Cas12a的調控開關，在UDG添加后產生時間依賴性的熒光增強。尿嘧啶數量從1個增加到4個時，Cas12a信號轉導的初始反應速率顯著加快，這表明多個AP位點的產生加劇了發夾結構的不穩定性，從而促進了Cas12a RNP的結合與激活。使用不同Cas12a同源蛋白（如LbCas12a、FnCas12a和AsCas12a）的實驗均證實了該平臺的普適性。變性PAGE分析進一步證實，Cas12a的順式切割活性僅發生在含有尿嘧啶殘基且經過UDG處理的DNA傳感器中。熱變性實驗和凝膠遷移實驗均支持了修復誘導結構重排的機制。
基于Cas12a的實時監測人細胞裂解液中的UDG活性
研究團隊在野生型HEK293T細胞裂解液中測試了基于Cas12a的UDG活性檢測方法。該檢測法能夠在0.0085至0.65 U/mL的動態范圍內檢測UDG活性，檢測限（LOD）低至0.0009 U/mL。加標回收實驗證實了該方法在復雜生物樣品中檢測UDG活性的準確性。此外，在過表達尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG）的HEK293T裂解液中，該方法實現了對UNG活性的高靈敏度實時監測。通過添加尿嘧啶DNA糖基化酶抑制劑（UGI），觀察到熒光強度的劑量依賴性降低，證明了該檢測法能夠實時監測糖基化酶活性并直接篩選抑制劑。
合成DNA傳感器將hOGG1活性重連至Cas12a信號放大
為了證明該策略的通用性，研究團隊進一步測試了針對人類8-氧鳥嘌呤DNA糖基化酶1（hOGG1）的傳感器。hOGG1是一種雙功能糖基化酶，不僅能切除受損堿基，還能在生成的AP位點處切割磷酸二酯鍵。研究人員設計了一種hOGG1響應型DNA傳感器，在其crRNA靶向序列中部插入單個8-氧鳥嘌呤（8-oxoG）損傷。當hOGG1切除8-oxoG后，其相關的裂解酶活性會導致鏈的切割，釋放一個短DNA片段，從而破壞發夾結構，暴露靶鏈上的未配對核苷酸，最終使得Cas12a RNP能夠結合并激活，切割熒光報告分子。該平臺對hOGG1的檢測限達到14.2 ng/mL，并顯示出高特異性。在HEK293T細胞裂解液中的加標回收實驗顯示回收率在101%至115%之間，驗證了該單步檢測方法的準確性。
基于Cas12a的hOGG1抑制劑高通量篩選
利用該單步CRISPR檢測法的高靈敏度和快速響應特性，研究團隊將其應用于hOGG1小分子抑制劑的高通量篩選。測試了多種已知的hOGG1和Fpg抑制劑，包括O8（Inh #1，抑制AP裂解酶活性）和SU0268（Inh #2，抑制DNA結合和堿基切除活性），以及2-硫代黃嘌呤（2TX）的衍生物（Inh #3, #4, #5）。實驗獲得了相應的半數抑制濃度（IC50）值，并通過熱圖清晰展示了不同抑制劑對細菌和人類酶的選擇性抑制效果。該單步篩選在96孔板中進行，每次測試成本低廉，且Z‘因子為0.82，證明了其適用于高通量自動篩選的魯棒性，為DNA修復靶向治療提供了應用潛力。
結論
本研究開發的合成DNA傳感器能夠在酶修復后激活CRISPR-Cas12a，實現了對DNA糖基化酶活性的快速、實時監測。該平臺利用修復酶對損傷DNA堿基的底物特異性，將損傷識別轉化為放大的熒光輸出，解決了傳統活性檢測方法依賴化學修飾探針、靈敏度低、步驟繁瑣等局限性。與已報道的CRISPR策略相比，該系統無需輔助酶、復雜的探針結構或順序添加試劑，信號放大僅通過簡單混合溶液中的組分即可實現。其基于DNA發夾底物的設計模擬了DNA修復酶的自然靶標，簡單的設計使其能夠輕松適配不同的DNA損傷，支持在DNA修復通路中的廣泛應用。除了生物分析應用，該平臺為DNA修復抑制劑的通量篩選提供了強大框架，并有助于整合到響應細胞狀態的合成基因電路以及實時監測DNA修復和藥物篩選中。
