《Biochemical Journal》：Structural basis for inhibition of SpyCas9 by the anti-CRISPR protein AcrIIA26
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為解決噬菌體如何對抗細菌的CRISPR-Cas9免疫系統這一關鍵科學問題，研究人員圍繞AcrIIA26抑制SpyCas9的分子機制開展研究。通過解析3.0 ?分辨率的冷凍電鏡結構，發現AcrIIA26采用獨特的折疊，通過模擬雙鏈DNA的5-螺旋束占據PAM識別位點，同時利用4-螺旋束結合Cas9的REC結構域，立體阻礙其激活所必需的構象變化，從而實現對Cas9的雙重抑制。該研究揭示了PAM識別是Cas9功能的關鍵脆弱點，為設計更優的Cas9“關閉開關”以改善基因組編輯應用提供了結構基礎。
在微觀世界中，細菌與噬菌體之間進行著一場永無止境的“軍備競賽”。細菌演化出了強大的CRISPR-Cas適應性免疫系統，能夠像精確制導的導彈一樣，識別并切割入侵的噬菌體DNA。作為反擊，噬菌體則進化出小巧而高效的“反導系統”——抗CRISPR（Anti-CRISPR, Acr）蛋白，用以抑制Cas蛋白的功能，逃避免疫清除。這些Acr蛋白種類繁多，但大多機制不明，猶如隱藏的“特工”，阻礙著我們對這一精密防御系統的深入理解。其中，AcrIIA26是一種能抑制化膿性鏈球菌Cas9（SpyCas9）DNA結合能力的II-A型Acr，但其具體如何“鎖死”Cas9，一直是個未解之謎。理解這些Acr的抑制機制，不僅是揭示生命進化“軍備競賽”的關鍵，也為在應用層面精確控制CRISPR-Cas9這把“基因剪刀”提供了可能，特別是為了解決其“脫靶效應”這一臨床應用的主要障礙。
為了闡明AcrIIA26的抑制機制，研究人員展開了系統的研究。他們成功解析了AcrIIA26與裝載了單鏈向導RNA（single-guide RNA, sgRNA）的SpyCas9所形成的復合物的冷凍電鏡結構，分辨率達到3.0 ?。通過結合生化突變分析，揭示了AcrIIA26采用了一種前所未有的雙重抑制策略，有效地將Cas9“凍結”在非活性狀態。這項重要的研究成果發表在《Biochemical Journal》上。
研究人員主要運用了以下幾個關鍵技術方法：首先，利用分子克隆技術構建了帶有His標簽的AcrIIA26及其突變體的表達載體，并在大腸桿菌中進行蛋白質表達與純化，通過鎳柱親和層析和尺寸排阻色譜獲得高純度蛋白。其次，通過體外DNA切割實驗，評估了AcrIIA26及其關鍵位點突變體對SpyCas9切割活性的抑制效果，驗證了其功能。最關鍵的是，利用單顆粒冷凍電子顯微鏡技術，對預先形成的SpyCas9-sgRNA-AcrIIA26復合物進行樣品制備、數據收集與處理，最終解析了其高分辨率三維結構。此外，還使用了AlphaFold3進行結構預測輔助建模，并通過局部細化技術提升了柔性區域（如HNH結構域）的密度圖質量。
研究結果
AcrIIA26與SpyCas9-sgRNA復合物的結構
研究人員首先證實了純化的AcrIIA26能以濃度依賴的方式抑制SpyCas9的DNA切割活性。隨后，他們利用冷凍電鏡解析了復合物結構。AcrIIA26具有一種全新的折疊方式：一個中心五鏈反平行β-片層，兩側分別是一個五α螺旋束（5-helix bundle）和一個四α螺旋束（4-helix bundle），整體形狀像一把弓。其分子表面呈高度酸性。值得注意的是，5-螺旋束帶負電的表面形狀
