基因表達調控是理解靶基因功能的核心。CRISPR-Cas9系統已在斑馬魚中廣泛應用于多種基因修飾。然而，轉錄敲低技術長期依賴嗎啉寡核苷酸（MO），但其存在毒性和脫靶效應。雖然CRISPRi（CRISPR interference）能抑制轉錄活性，但在合子基因激活前，胚胎發生早期依賴于母源mRNA，這是CRISPRi無法控制的。Cas13（一種Ⅱ類VI型CRISPR-Cas RNA內切核酸酶）能誘導RNA降解，其中CasRx（即RfxCas13d）在斑馬魚胚胎中能高效下調特定mRNA轉錄本且無明顯毒性。

盡管如此，大多數斑馬魚實驗仍依賴向胚胎注射mRNA或純化的Cas效應蛋白及一個或多個向導RNA（gRNA）。然而，理解靶基因的分子機制或模擬人類疾病通常需要能進行組織特異性或時間控制的轉基因動物。雖然轉基因Cas9斑馬魚已用于基因敲除（KO），但尚未有文獻記載能實現可控基因激活、下調或轉錄敲低的轉基因CRISPR斑馬魚。與Cas9驅動的基因敲除不同，通過CasRx實現轉錄敲低，或通過CRISPRa/CRISPRi實現基因上下調，需要CRISPR效應蛋白持續高水平表達。注射Cas效應蛋白的mRNA或蛋白只能短暫引入高水平表達，而這些效應蛋白的轉基因表達往往不足以誘導所需效果。

二元表達系統為增強基因表達提供了強大方法，并具有組織特異性或時間控制的靈活性。Gal4/UAS系統是果蠅中的主要二元系統，但其在斑馬魚中的實用性受到兩個限制：UAS沉默和Gal4毒性。在脊椎動物中，UAS元件內CpG二核苷酸的甲基化積累可導致其沉默。雖然經過修飾的UAS版本顯示出減少的雜色斑和基因表達沉默，但在多個世代中UAS啟動子的轉錄沉默仍然存在。為避免GAL4/UAS系統中的甲基化問題，在斑馬魚中引入了無CpG元件（tUAS）和色氨酸阻遏物（TrpR），但該驅動子的過度毒性限制了其使用。

Q二元表達系統源自真菌粗糙脈孢菌，由于QF反式激活子的共有結合位點中缺乏CpG二核苷酸，因此能有效防止CpG介導的甲基化引起的沉默。本研究中，作者團隊介紹了一種在轉基因斑馬魚中精確、穩健地控制轉錄敲低和基因激活的方法。這一成就是通過將CRISPR-Cas效應蛋白表達與增強的QFvpr（QF DNA結合域與三個轉錄激活因子VP64、p65、Rta融合）/QUAS二元表達系統（稱為CRISPR-Q系統）相結合實現的。

為了在斑馬魚中開發更強大的二元轉基因系統，團隊測試了增加VP16重復序列的數量是否能增強轉錄激活。通過構建一系列Gal4變體進行比較，發現除了VP64活性略有提高外，增加VP16重復序列并未顯著提高轉錄激活。隨后，選擇VPR（VP64-p65-Rta融合體）作為激活域（AD），因為它包含VP64，并且被證明是跨多種生物體最有效可靠的反式激活因子之一。如預期，體外實驗顯示Gal4vpr顯著提高了熒光素酶報告基因的轉錄。同樣，團隊構建了QFvpr反式激活子，在斑馬魚胚胎中測試表明，QFvpr顯示出比QF2高得多的報告基因激活能力，且活性與Gal4vpr相當。

接著檢測了QFvpr和Gal4vpr在斑馬魚胚胎中的相對毒性。結果顯示，注射Gal4vpr的胚胎即使在低濃度（如15皮克）下也無法存活，而大多數胚胎能更好地耐受QFvpr。這些結果表明Gal4 DBD（DNA結合域）本質上比QF DBD更具毒性。隨后成功培育出攜帶ubb:QFvpr-CK的斑馬魚種魚，但未能建立攜帶ubb:Gal4vpr-CK的種魚系。這表明QFvpr與Gal4vpr以及KalTA4相比，毒性顯著降低。

團隊嘗試用QFvpr/QUAS系統驅動CRISPR效應蛋白的表達。在測試中，發現ubb驅動的QFvpr可能導致毒性，且CasRx表達較弱。因此，團隊轉向使用熱激啟動子hsp70l驅動的轉基因斑馬魚系Tg(hsp70l:QFvpr-CK)。熱激處理后，觀察到EGFP的明亮表達，表明CasRx的轉錄激活很強。重要的是，與Gal4/UAS系統不同，在F4代中未發現QFvpr/QUAS二元系統出現基因沉默，這與之前的研究報告一致。

為了實現CRISPR效應蛋白的穩健可靠表達，團隊將QFvpr/QUAS二元系統與由5×QUAS啟動子驅動的CRISPR效應蛋白偶聯，從而生成CRISPR-Q系統。為了上調內源性基因表達，選擇dCas9vpr作為轉錄激活的效應蛋白。為了通過Cas13蛋白進行轉錄敲低，團隊首先比較了CasRx和Cas13X（即Cas13bt3）的敲低效率，總體上CasRx比Cas13X顯示出更強的敲低活性，因此選擇CasRx來生成用于轉錄敲低的轉基因斑馬魚。

CRISPR效應蛋白的表達由5×QUAS啟動子在結合QF反式激活子后驅動。通過將攜帶啟動子特異性QFvpr和5×QUAS:Cas效應蛋白的雙轉基因（2Tg）斑馬魚與表達針對CasRx或dCas9的特異性gRNA的另一轉基因品系雜交，生成了三轉基因（3Tg）斑馬魚。這些3Tg胚胎或幼魚用于評估RNA表達水平，并與2Tg對照比較對刺激的行為反應。

為了測試CRISPR-Q_KD是否能有效敲低斑馬魚中的轉錄本，團隊進行了實驗。通過每日短暫熱激處理，觀察到CasRx的強轉錄激活。大多數胚胎發育正常，熱激處理可在后續幾天重復以延長基因調控的持續時間。

通過qPCR檢測，在表達針對smn1的gRNA的3Tg斑馬魚中，smn1表達顯著降低。團隊進一步測試了CRISPR-Q_KD能否同時敲低來自重復基因的兩個mRNA靶點，針對tardbp（tardbp和tardbpl）或gpx4（gpx4a和gpx4b）兩個旁系同源基因的3Tg斑馬魚幼魚，顯示這些基因的表達水平均顯著降低。RNA-seq分析表明，CRISPR-Q_KD在smn1和tardbp旁系同源基因的表達上顯示出適度的降低，且脫靶敲低有限。Western印跡分析也觀察到GPX4蛋白水平顯著降低。

團隊還評估了CasRx在斑馬魚中的附帶活性。共注射CasRx mRNA和靶向mGreenLantern（mGL）的gRNA以及mGL和mKate2的mRNA，發現當mGL mRNA注射量超過50皮克時，mKate2熒光減少，表明存在CasRx介導的附帶活性。然而，在表達CRISPR-Q_KD的轉基因魚中，未檢測到附帶效應或毒性。這些結果表明，轉基因CRISPR-Q_KD系統不會誘導可檢測的附帶活性或毒性。

敲低效率受Cas效應蛋白和gRNA表達水平的影響。團隊發現，QFvpr/QUAS系統誘導的CasRx mRNA水平與注射300皮克mCasRx的24小時胚胎中的水平相當。有趣的是，從1皮克到100皮克的gRNA注射量誘導了相當的敲低效率，表明10皮克gRNA可能就足夠了。此外，將mCasRx注射到gRNA轉基因胚胎中可產生顯著的敲低效果。這些結果表明，雖然CasRx表達水平和gRNA豐度對整體效率有重要貢獻，但靶點選擇在敲低效率中也起著重要作用。

轉基因拷貝數會影響其表達水平。對CRISPR-Q_KD系統各組分的拷貝數定量顯示，QFvpr為1-2拷貝，CasRx為1-3拷貝，gRNA為3-12拷貝。這些發現表明，CRISPR-Q系統可以通過Tol2系統有效建立。

SMN蛋白的缺失會導致運動神經元的功能缺陷甚至死亡，引起脊髓性肌萎縮癥（SMA）。同樣，斑馬魚中smn1的缺失會導致運動神經元和肌肉缺陷、運動活動減少以及母體和合子缺陷情況下4-5天后的早期死亡。通過CRISPR-Q_KD介導的smn1敲低，團隊觀察到3Tg幼魚的雙折射性（反映肌肉完整性）輕微但顯著降低。在觸碰誘發逃逸試驗中，與2Tg幼魚相比，3Tg幼魚表現出較弱或緩慢的逃逸反應，逃逸距離顯著減少。這些缺陷可以通過注射在靶點內含有突變的smn1mRNA來挽救。

為了研究潛在的運動功能缺陷，團隊檢測了3Tg幼魚在各種刺激下的運動行為。總體而言，在黑暗條件下以及暴露于紫光時，3Tg幼魚的運動活動略有但顯著降低。同樣，3Tg幼魚在振動驚嚇反應試驗（VSRA）中也顯示出輕微但顯著的降低。這些結果表明，CRISPR-Q_KD介導的斑馬魚smn1敲低足以重現SMA疾病的表型。

TDP-43是一種廣泛表達的核RNA/DNA結合蛋白，參與多種RNA代謝過程。TDP-43的失調及其細胞質沉積與多種神經退行性疾病有關。在斑馬魚中，雖然tardbp突變體由于存在其旁系同源物tardbpl而沒有表現出明顯的表型，但tardbp和tardbpl的雙重純合突變體會表現出肌肉、運動神經元和血管系統的各種缺陷，導致7-8天后早期死亡。

鑒于tardbp和tardbpl都能被CRISPR-Q_KD顯著敲低，團隊觀察到3Tg幼魚在所有光照條件下的運動活動均顯著降低，特別是在黑暗或紫光下。同時，tardbp和tardbpl的雙重敲低導致驚嚇反應顯著降低。此外，通過免疫染色評估3Tg幼魚的肌肉完整性，發現與2Tg或未熱激幼魚相比，熱激處理進行雙重敲低的3Tg幼魚中異常或退化的肌細胞顯著增加。總之，通過CRISPR-Q_KD同時敲低tardbp和tardbpl導致斑馬魚幼魚出現表型變化，包括肌肉損傷和運動活動受損，這些都是ALS的特征。

團隊研究了dCas9vpr激活劑水平的增加是否能誘導內源性基因的持續轉錄激活。為此，選擇lin28a、myca和sox9b來測試基因激活。為了提高轉錄激活的概率，為每個基因設計了三個靶向基因近端啟動子區域的sgRNA，并將其克隆到一個質粒中，生成3×zU6:sgRNA構建體。

通過每日短暫熱激處理，觀察到dCas9vpr的顯著表達。大多數胚胎發育正常。qPCR結果顯示，與2Tg條件相比，3Tg斑馬魚幼魚中lin28a和sox9b的表達水平顯著更高。轉錄組譜顯示lin28a和sox9b顯著上調。鑒于sox9b的激活，團隊研究了sox9b的上調是否能激活其靶基因。測試了九個據報告受sox9b調控的基因的表達水平，其中四個基因顯著上調，其余基因也顯示出表達增加的趨勢。相比之下，作為陰性對照的sox9a表達保持不變。因此，CRISPR-Qa系統能夠充分增強CRISPRa活性，使得在轉基因斑馬魚中持續功能性激活內源性基因成為可能。

團隊還評估了CRISPR-Q_KD或CRISPR-Qa的表達是否會誘導細胞應激或死亡。通過TUNEL（末端脫氧核苷酸轉移酶dUTP缺口末端標記）試驗和應激反應標志基因的RT-qPCR分析，未檢測到細胞死亡或應激反應。

斑馬魚為高通量篩選、藥物發現和體內成像提供了多種優勢。團隊測試了CRISPR-Q系統是否能在年齡較大的魚中實現有效的基因調節。在幼年和成年2Tg和3Tg斑馬魚中進行CRISPR-Q_KD和CRISPR-Qa實驗，隨后進行熱激處理。觀察到顯著的GFP熒光，表明CasRx或dCas9vpr的穩健表達。重要的是，在熱激后未檢測到斑馬魚有不良影響。這些結果表明，斑馬魚可以耐受長期每日熱激處理，突出了CRISPR-Q系統長期應用的潛力。

通過RT-qPCR評估基因表達變化，誘導CasRx導致幼魚中smn1、tardbp、tardbpl、gpx4a和gpx4b的表達水平顯著降低。在成年魚的組織中也觀察到smn1的顯著降低。相反，CRISPR-Qa的激活導致幼魚中lin28a顯著上調。此外，在成年魚中觀察到sox9b的強勁誘導。這些發現表明，由熱激啟動子驅動的CRISPR-Q系統不僅能有效調節早期胚胎和幼魚的基因表達，也能調節幼年和成年斑馬魚的基因表達，從而拓寬了其應用范圍。

組織特異性表達是轉基因的關鍵組成部分。團隊測試了CRISPR-Q系統在組織特異性環境中的效率。為此，工程構建了一個包含CRISPR-Q系統的單質粒，該系統整合了由cmlc2啟動子驅動的QFvpr組織特異性表達（用于心臟表達）、Cas效應蛋白（例如5×QUAS:CasRx/dCas9vpr-2A-EGFP）和gRNA/3×sgRNA。

選擇對心臟發育至關重要的心臟特異性基因myl7和myh6作為CRISPR-Q_KD的靶點。顯微注射靶向myl7或myh6的CRISPR-Q_KD質粒后，選擇心臟中表現出GFP表達的胚胎進行心臟形態分析和mRNA水平評估。結果顯示，表達帶有gMyl7或gMyh6的CRISPR-Q_KD的幼魚mRNA水平與對照組相比顯著降低。此外，觀察到注射帶有gRNA的CRISPR-Q_KD的幼魚心臟變形發生率顯著高于未注射gRNA的幼魚，并且注射帶有myl7靶點內突變的myl7mRNA可以挽救心臟缺陷。這些結果表明，CRISPR-Q_KD可以通過顯微注射高效地用于瞬時的組織特異性基因調節。

接下來，團隊生成了靶向tbx5a和asb5a（用于CRISPR-Q_KD）以及lin28a（用于CRISPR-Qa）的心臟特異性轉基因斑馬魚品系。為了獲得更有效的敲低，首先篩選了靶向tbx5a和asb5a的gRNA。單個gRNA顯示出可變的敲低效率。然而，結合兩個gRNA比每個單gRNA增加了敲低效果。這些結果強調了選擇最佳靶點位置以及應用每個基因多個gRNA以提高敲低效率的重要性。

通過雜交鏈式反應（HCR）染色評估靶基因的組織特異性表達，觀察到在表達帶有gTbx5a的CRISPR-Q_KD的胚胎中，心臟信號顯著降低，而其他組織的染色強度保持相似。同樣，針對asb5a的HCR染色顯示心臟特異性表達，而在表達帶有gAsb5a的CRISPR-Q_KD的幼魚中，這種表達幾乎完全消失。

對于組織特異性CRISPR-Qa，首先使用RT-qPCR測量lin28a表達，在表達帶有gLin28a的CRISPR-Qa的胚胎中觀察到lin28a顯著上調。隨后進行lin28a的HCR染色，證實了在表達帶有gLin28a的CRISPR-Qa的胚胎中心臟特異性表達顯著增加。

此外，團隊測試了使用急性注射方法的另一個啟動子。首先篩選了六個靶向tyr（編碼酪氨酸酶，為黑色素合成所需）的gRNA，這些gRNA顯示出高度可變的活性。構建了一個包含ubb:QFvpr、5×QUAS:CasRx-2A-EGFP和zU6:tyrgRNA的單質粒。值得注意的是，注射攜帶gTyr-6或gTyr-4+6質粒的胚胎在48小時后表現出明顯的色素沉著減少。這些結果表明，普遍表達的、由ubb啟動子驅動的CRISPR-Q_KD系統可以有效誘導基因敲低。

總之，這些結果表明CRISPR-Q系統可以在轉基因斑馬魚中高效實現組織特異性基因調節。

自CRISPR系統作為基因編輯的強大工具出現以來，已經創建了各種用于基因調控的CRISPR系統。然而，在斑馬魚中，這些系統僅用于急性注射，這限制了它們在后期階段或在空間或時間背景下研究基因功能或模擬人類疾病的有用性。實現這一目標的一個重大挑戰在于確保斑馬魚中Cas效應蛋白的一致和強表達。為了解決這個問題，采用穩健的二元表達系統至關重要。團隊開發了一種稱為QFvpr/QUAS的增強型二元表達系統，旨在誘導和控制轉基因斑馬魚中Cas效應蛋白的穩健表達。已經成功證明，QFvpr/QUAS驅動的Cas效應蛋白CRISPR-Q_KD和CRISPR-Qa可用于基因調控，例如轉錄敲低和基因激活。這種改進的CRISPR系統為研究人員在斑馬魚中研究基因功能或模擬人類疾病提供了巨大潛力。

斑馬魚胚胎發育早期CasRx的表達可能對胚胎有害。雖然CasRx和gRNA的急性注射可能不會表現出明顯的毒性，但這可能歸因于CasRx蛋白/mRNA和gRNA的降解。團隊偶爾在表達高水平CasRx的轉基因斑馬魚中觀察到毒性。這可能是由于CasRx的附帶活性，盡管在實驗中未檢測到。值得注意的是，最近的研究表明，CasRx可能會在轉基因小鼠中因附帶活性導致意外基因損傷而產生毒性和致死性。高保真Cas13變體hfCas13d和hfCas13X的工程化已顯示出無可辨別的附帶效應，從而在小鼠中沒有毒性或致死性。鑒于這些進展，評估這些高保真Cas13變體在斑馬魚轉基因系統中的有效性將非常有意義。

關于轉錄敲低，觀察到CasRx在RNA敲低中的效率存在可變性，并且在轉基因斑馬魚中似乎不如細胞實驗中有效。這凸顯了改進預測算法以有效識別最高效gRNA的必要性，并強調了測試多個gRNA以確保預期結果的重要性。團隊還強烈建議每個基因使用兩到三個gRNA以確保高效敲低。事實上，先前采用急性CasRx介導敲低的研究一直使用每個基因三個gRNA。

在瞬時Cas13d遞送系統中，gRNA劑量與敲低效率之間的關系可能受時間動態和飽和效應的影響。在注射后的早期時間點，Cas13d和gRNA可能接近功能飽和，限制了檢測線性劑量-反應關系的能力。在后期階段，隨著gRNA和Cas13d蛋白或mRNA的降解，gRNA劑量的差異可能變得更加明顯。總體而言，這些考慮因素突出了在瞬時敲低實驗中解釋gRNA劑量-反應關系的復雜性。

在開發QFvpr/QUAS二元表達系統的過程中，團隊最初選擇了兩個獨立的組件，但隨后遇到了一些挑戰。首先，生成2Tg斑馬魚耗時且需要與zU6-gRNA轉基因斑馬魚品系進行后續雜交。其次，由于每個轉基因拷貝數的可變性，2Tg或3Tg斑馬魚品系的表達水平可能差異很大。基于這些觀察，團隊推薦采用將QFvpr和5×QUAS-Cas效應蛋白組合成單個Tol2質粒的單質粒二元系統。此外，將zU6-gRNA整合到單質粒二元系統中，允許將一個包含所有三個組件的質粒注射到斑馬魚胚胎中。這種簡化的方法不僅節省時間，而且有可能產生更可靠的結果。

團隊還發現，轉基因魚的平均敲低效率通常低于瞬時注射達到的效率。盡管如此，盡管smn1和tardbp的敲低效率相對較低（約30%–40%），但這些水平足以誘導輕微但可檢測的表型，這可能有利于研究具有嚴重表型或早期致死性的基因或疾病模型。然而，這種敲低水平可能不足以引發其他基因的明顯表型。為了提高轉基因魚的敲低效率，團隊提出了幾種策略，包括篩選最有效的gRNA、結合多個最佳gRNA以及增加CasRx表達水平。在本研究中，使用了五次重復的QUAS元件，因為它提供了與瞬時實驗中14×UAS相當的激活水平。鑒于QUAS比UAS更能抵抗基因沉默，增加QUAS重復次數（例如10×或15×）很可能進一步增強Cas效應蛋白的反式激活。此外，當前的構建體并未針對斑馬魚進行密碼子優化。CRISPR-Q系統（尤其是CRISPR-Qa）的表達水平有時可能不理想。對CRISPR-Q組件（尤其是Cas效應蛋白）進行密碼子優化可能會進一步提高斑馬魚中的表達效率。

關于CRISPRa，當前版本的CRISPR-Qa為每個靶基因使用了三個zU6驅動的sgRNA。通常，使用CRI