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基因與順式調控元件（CREs）間的相互作用機制尚缺乏高效解析工具。研究人員開發了結合超高效dHyperLbCas12a與RNA Pol II表達crRNA陣列的系統，實現了在原代免疫細胞與誘導多能干細胞中對CREs的高通量、多重并行激活與抑制操控。該工作為在復雜生物學系統中解析CREs的組合功能與基因調控網絡提供了強大工具。
在生命科學的前沿探索中，理解基因之間以及基因與調控它們的“開關”——順式調控元件（cis-regulatory elements, CREs）——之間的復雜相互作用，是揭示發育、疾病等眾多生物學過程核心機制的關鍵。傳統的遺傳學方法往往一次只能研究一個或少數幾個基因或元件，效率低下且難以捕捉復雜的網絡關系。近年來，CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，規律間隔成簇短回文重復序列）技術的出現，特別是其衍生工具CRISPR干擾（CRISPR interference, CRISPRi）和CRISPR激活（CRISPR activation, CRISPRa），革命性地實現了對基因和CREs功能的高通量篩選。然而，一個突出的瓶頸依然存在：我們能夠高效地分別敲低或激活成千上萬個靶點，卻難以系統性地探究這些靶點之間的相互作用關系，尤其是當需要同時操控多個CREs來模擬復雜的體內調控環境時。為了突破這一限制，一支研究團隊開展了一項創新性工作，他們開發了一套全新的、能夠實現高度多重化并行操控基因表達的系統，并將其成功應用于解析CREs的組合功能。這項重要研究成果發表在《Nature Communications》上。
為開展此項研究，作者主要運用了以下幾項關鍵技術：首先，他們改造并優化了來源于毛螺菌科細菌（Lachnospiraceae bacterium）的Cas12a酶，獲得了其超高效催化失活版本dHyperLbCas12a，作為基因編輯的“導航”核心。其次，他們創新性地利用RNA聚合酶II（RNA Polymerase II）來驅動表達超長的CRISPR RNA（crRNA）陣列，這使得單次轉錄能夠產生包含大量不同靶向序列的crRNA混合物，從而實現高度多重化的基因靶向。最后，他們將dHyperLbCas12a與不同的轉錄效應結構域（如激活域或抑制域）融合，構建出功能多樣的效應器，并在原代培養的免疫細胞以及誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）分化等多個具有挑戰性的生物系統中進行了驗證與應用。
研究結果
dHyperLbCas12a與Pol II驅動的crRNA陣列實現高效多重化操控
研究人員首先證實，與常用的dCas9系統相比，他們開發的dHyperLbCas12a效應器具有更高的靶向效率和更低的脫靶效應。更重要的是，通過使用RNA Pol II（而非傳統的Pol III）來轉錄包含多達數十個不同靶向單元的crRNA長陣列，他們成功實現了在同一細胞群體中，對大量不同基因或CREs的同時、并行操控。這種設計突破了傳統CRISPR篩選在多重性上的限制。
在原代細胞和iPSCs中驗證系統的多功能性
研究團隊并未滿足于在易于操作的細胞系中的驗證。他們將系統應用于更難轉染和操作的原代免疫細胞（如T細胞）中，展示了dHyperLbCas12a系統在這些重要但脆弱的細胞類型中依然能夠高效工作，實現基因的激活或抑制。此外，在iPSCs向特定細胞類型分化的過程中，利用該系統對關鍵轉錄因子進行時序性操控，證明了其在研究復雜發育過程中的潛力。
開發同時進行激活與抑制的策略
為了進一步增強系統的靈活性和模擬更真實的生物學場景，作者還開發了創新策略，使得dHyperLbCas12a能夠被用于在同一實驗中對不同的靶點同時實施激活和抑制。這為研究激活性和抑制性調控元件如何協同工作以精確控制基因表達網絡提供了前所未有的工具。
解析CREs對基因表達的獨立與組合貢獻
作為系統能力的終極展示，研究人員利用dHyperLbCas12a介導的高通量CRISPRi篩選，系統地剖析了多個CREs對單個靶基因表達的貢獻。他們不僅評估了每個CRE單獨敲低的影響，更設計了實驗來探究當兩個或多個CRE被同時抑制時，其效應是簡單的疊加，還是存在協同或拮抗作用。這項工作首次在高度多重化的水平上，實現了對CREs組合功能的定量解析。
研究結論與意義
本研究成功開發并驗證了一套基于dHyperLbCas12a和Pol II-crRNA陣列的強大工具箱。該系統的核心優勢在于其超高效和高度多重化的能力，能夠輕松實現同時對數十個甚至更多基因或CREs的精確調控（激活或抑制）。這超越了現有基于dCas9的CRISPRi/a系統在多重性和效率上的局限。研究的重要意義體現在三個方面：首先，在技術層面，它提供了一種靈活、可擴展的框架，能夠兼容不同的效應結構域，適用于從永生細胞系到原代細胞、干細胞等多種生物學系統，極大拓寬了CRISPR調控工具的應用范圍。其次，在方法學層面，所開發的同步激活/抑制策略以及對CREs進行組合功能篩選的方法，為研究復雜的基因調控邏輯和相互作用網絡建立了新的范式。最后，在生物學認知層面，這套工具使得大規模、系統性地解碼非編碼基因組區域（如增強子、沉默子等CREs）的功能，特別是它們如何通過組合來決定細胞命運、免疫應答或疾病狀態，成為了可能。這項研究為未來在基因組尺度上繪制動態的基因調控互作圖譜，以及基于此開發新的疾病治療策略，奠定了堅實的技術基礎。
