《Biosensors and Bioelectronics》：Highly fluorescent copper nanoclusters as programmable reporters for CRISPR/Cas12a-based detection of bacterial DNA
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CRISPR/Cas12a與DNA-模板銅納米簇（CuNCs）結合開發了一鍋端熒光檢測法，實現皮摩爾級靈敏度細菌DNA檢測，適用于點-of-care診斷。
A.G. Carota|F. Spiaggia|N. Poma|P. Palladino|D. Cuffaro|F. Vivaldi|C. Ravelet|F. Di Francesco|M. Minunni
CNR-電子與信息通信工程研究所，意大利比薩
摘要
早期且便捷的病原體檢測對全球公共衛生安全至關重要，這需要快速、經濟且適用于現場檢測的診斷方法。本研究提出了一種成本低廉、檢測迅速的一鍋法熒光檢測方法，該方法利用了基于DNA模板構建的銅納米簇（CuNCs）的獨特光學特性。這些納米簇由于合成過程環保、光穩定性高以及斯托克斯位移大，成為傳統熒光染料的可持續替代品。該檢測方法將CuNCs與CRISPR/Cas12a系統結合，實現了可編程且高度特異性的目標識別。當目標分子與CuNCs結合時，Cas12a/gRNA復合物被激活，從而切割負責CuNCs形成的DNA模板，導致熒光顯著減弱。通過系統評估多種發夾結構及多胸腺嘧啶DNA序列，最終選定了一種富含腺嘌呤-胸腺嘧啶（AT-rich）的莖環結構作為報告基因，該結構在目標識別時能產生強烈的熒光信號并完全關閉熒光。最終開發的CRISPR-CuNCs檢測方法達到了皮摩爾級別的靈敏度，能夠準確檢測參考菌株、臨床分離株及添加了DNA的血清樣本中的大腸桿菌 DNA，且無需使用熒光染料-淬滅劑探針或多步驟操作。總體而言，本研究證明了將CRISPR/Cas12a的可編程性與DNA模板銅納米簇的多功能性及低成本相結合，可以構建出一個穩健且易于使用的分子診斷平臺，具有很大的現場應用潛力。
引言
金屬納米簇（NCs）是一種超微材料——通常尺寸小于1-2納米——其性質介于孤立原子和較大納米顆粒之間（Maity等人，2019年）。由于尺寸依賴性的量子限制，它們具有離散的能級和強烈的光致發光（PL）特性，這與傳統金屬納米顆粒的光學行為不同（后者由電子集體振蕩產生）。這些特性，加上優異的斯托克斯位移、高光穩定性和簡單的合成方法，使得NCs在光電學、光催化、成像和傳感領域具有廣泛應用價值（Lettieri等人，2022年；Zhao和Li，2020年）。銅納米簇（CuNCs）尤其具有吸引力，因為銅相對于貴金屬來說價格低廉、毒性低且儲量豐富。CuNCs已被廣泛用作傳感探針，既可以通過分析物誘導生長實現，也可以通過與表面配體的相互作用實現（An等人，2020年）。其合成可以通過多種試劑穩定，包括蛋白質、肽、聚合物和小分子及寡核苷酸（Guo等人，2016年；Lettieri等人，2021年、2022年；Spiaggia等人，2025年）。其中，基于DNA模板的CuNCs（DNA-CuNCs）因其可編程性而脫穎而出。雙鏈DNA（dsDNA）能有效促進CuNCs的形成，而三鏈和大多數單鏈DNA（ssDNA）則不能（Rotaru等人，2010年）。例外情況是長度超過20個堿基的多胸腺嘧啶（poly-T）ssDNA序列，其熒光強度隨長度增加而增強。富含腺嘌呤-胸腺嘧啶（AT-rich）的dsDNA序列也被證明是有效的模板（Qing等人，2013年；Rotaru等人，2010年；Song等人，2015年；Spiaggia等人，2025年）。在文獻中使用的不同DNA模板中，Peng等人用于檢測S1核酸酶活性的DNA-CuNCs模板因其優異的光學特性和更高的熒光強度而脫穎而出（Peng等人，2018年）。他們的DNA模板由一個24個堿基對（AT-TA）的莖區和一個單鏈環區組成。當CuNCs在這些模板上生長時，其熒光強度顯著提高。作者并未明確解釋為何這些序列會產生更高的熒光強度，僅指出“擁擠環境”，即受限的DNA結構，可能會顯著增強DNA-CuNCs的熒光強度。
規律間隔短回文重復序列（CRISPR）系統及其相關Cas蛋白已迅速從基因編輯工具發展成為強大的分子識別平臺，用于生物傳感（Aman等人，2020年；Bonini等人，2021b年；Dai等人，2019年；Gootenberg等人，2017年）。像Cas12a、Cas13和Cas14這樣的酶的輔助核酸酶活性使得核酸的檢測具有高度特異性和放大效果，使這些系統成為快速診斷的理想選擇，并為實現快速、經濟且便攜的診斷方法鋪平了道路，符合ASSURED（經濟、靈敏、特異、用戶友好、快速、穩健、無需設備、易于實施）的現場檢測標準（Chi等人，2022年；Del Giovane等人，2024年；Land等人，2018年；Najjar等人，2022年）。近年來，基于CRISPR/Cas的生物傳感器已與多種轉導技術（熒光、比色、電化學和發光）結合，表現出高度的適應性和模塊化（Bonini等人，2021a年；Carota等人，2024年；Ki等人，2022年；Zhou等人，2022年）。與等溫擴增方法（如重組酶聚合酶擴增（RPA）或環介導擴增（LAMP）的結合進一步提高了檢測限，實現了阿托摩爾級別的靈敏度，便于其在診斷中的應用（Tang等人，2022年；Wu等人，2021年；Yang等人，2024年；Zhang等人，2022年）。盡管取得了顯著進展，但許多基于熒光的CRISPR檢測方法仍依賴于合成熒光染料-淬滅劑探針、昂貴的試劑或多步驟流程，這些因素限制了其可擴展性和成本效益。為簡化信號讀取，研究人員開發了比色和基于紙片的檢測方法（X. Chen等人，2021年；Zhuang等人，2022年），但這些方法往往會犧牲靈敏度或需要酶的預激活步驟。因此，開發簡單、無需試劑且成本低廉的光學報告基因仍是實現易于使用和現場應用的CRISPR基診斷的關鍵步驟。在這方面，將可編程的CRISPR/Cas系統與基于DNA模板的銅納米簇（CuNCs）結合，為真正的一鍋法、低成本和快速病原體檢測及其他臨床相關應用帶來了希望。
在本研究中，我們系統地篩選了一組DNA序列，以確定最佳的CuNCs形成模板，并開發了一種完全基于一鍋法的細菌DNA檢測熒光檢測方法。選擇大腸桿菌作為模型生物，通過基于CRISPR/Cas12a的平臺實現檢測，該平臺在識別目標序列后會被激活。Cas12a介導的對合理設計的莖環模板的切割會干擾CuNCs的形成，從而在不到1小時內產生明顯的熒光開關響應。通過改變DNA模板的結構和濃度優化了檢測方法，并通過實驗設計（DoE）方法進一步優化，以確定關鍵參數的相互作用并指導未來的改進。最終開發的CRISPR–CuNCs檢測方法達到了皮摩爾級別的靈敏度，在人血清中有效運行，并成功檢測到了臨床分離株中的DNA。總體而言，這項工作介紹了一種新型的、低成本且靈敏的檢測策略，將可編程的CRISPR識別技術與基于DNA模板的銅納米簇相結合，為病原體檢測提供了一個有前景的平臺。
材料
三氫氯化物（Tris-HCl）、乙二胺四乙酸（EDTA）、NaCl、MgCl2、3-(N-嗎啉)丙磺酸（MOPS）和無RNase的水由Sigma-Aldrich（意大利米蘭）提供。L-抗壞血酸鈉由Tokyo Chemical Industry（TCI Europe N.V.，比利時Zwijndrecht）提供。五水合硫酸銅（CuSO4·5H2O）由Carlo Erba試劑公司（意大利Cornaredo）提供。所有凍干的HPLC級寡核苷酸（DNA-銅納米簇模板序列）也由該公司提供。
檢測原理
該檢測方法結合了Cas12a/gRNA復合物的高特異性和切割活性，以及基于特定DNA序列構建的銅納米簇（CuNCs）產生的強熒光。當識別到細菌目標DNA時，Cas12a/gRNA復合物被激活并切割用于支持CuNCs形成的單鏈DNA報告基因。這種切割破壞了模板DNA，導致熒光顯著減弱（開關機制）。
結論
本研究證明，基于DNA模板的銅納米簇（CuNCs）是高效的CRISPR基核酸檢測熒光報告基因。通過選擇能夠生成明亮CuNCs的莖環DNA模板，我們建立了一種一鍋法檢測方法，其中Cas12a的激活會導致熒光幾乎完全消失，從而實現靈敏的目標識別，而無需核酸擴增。CuNCs表現出穩定且可調的熒光特性，使得檢測結果更加可靠。
CRediT作者貢獻聲明
A.G. Carota：概念構思、研究設計、方法學研究、驗證、數據可視化、初稿撰寫。F. Spiaggia：概念構思、數據分析、驗證、初稿撰寫。N. Poma：研究設計、方法學研究、撰寫、審稿與編輯。P. Palladino：撰寫、審稿與編輯。D. Cuffaro：撰寫、審稿與編輯。F. Vivaldi：項目管理、監督、撰寫、審稿與編輯。C. Ravelet：資金獲取、撰寫、審稿與編輯。
利益沖突聲明
作者聲明他們沒有已知的可能影響本文研究的財務利益或個人關系。
致謝
AGC項目得到了GORU-IEIIT - BIOESAL項目（DIT.AD009.167）的支持，該項目由意大利國家研究委員會（CNR-IEIIT）的電子與信息通信工程研究所資助。作者FS、CR和MM感謝Franco-Italienne/Italo-Francese大學在2023年Vinci計劃（項目C3-161）下提供的聯合博士獎學金支持，該項目名為“利用基于銅的生物傳感器檢測臨床生物標志物”。
