《Epigenetics & Chromatin》：SETDB1/ATF7IP regulate the precise genome engineering of HUSH-regulated genes
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本文揭示了染色質調節因子對精確基因組編輯（PGE）的關鍵影響。研究者通過全基因組CRISPR篩選，發現組蛋白甲基轉移酶復合物SETDB1/ATF7IP及其下游人類沉默中樞（HUSH）復合物是單鏈DNA整合（ssDI）這一同源定向修復（HDR）子途徑的強力負調控因子。這一調控作用特異性地影響轉基因報告基因和HUSH調控的單拷貝基因，而非其他內源位點。文章論證了染色質結構（尤其是異染色質）是遺傳重組的重要屏障，并通過調節H3K9me3等表觀遺傳標記，為提高內源位點的PGE效率提供了新的策略思路。
背景
可編程核酸酶的應用徹底改變了基因組編輯和功能基因組學研究。CRISPR/Cas9系統能夠方便、精確地在體內引入靶向基因組損傷（通常是DNA雙鏈斷裂，DSBs）。在存在同源供體的情況下，這些損傷通過同源定向修復（HDR）途徑促進高效率的精確基因組編輯（PGE）。然而，由于DSBs可能導致基因組不穩定，大量研究工作已投入到僅需在染色體DNA一條鏈上制造缺口（nicking）的方法中，例如堿基編輯器。研究人員已在人類細胞中證明，使用Cas9的切口酶變體與寡脫氧核苷酸（ODN）供體進行的PGE，至少可以通過兩個HDR子途徑進行：合成依賴鏈退火（SDSA）和單鏈DNA整合（ssDI）。具體使用哪條途徑，取決于被切割的染色體鏈（正義鏈或反義鏈/Watson鏈或Crick鏈）以及供體ODN的鏈取向。
盡管哺乳動物SDSA的機制已被較為透徹地理解，但ssDI的機制尚不清楚。為了從遺傳學角度洞察ssDI，研究者進行了一項全基因組CRISPR敲除篩選，以鑒定那些在缺失時能夠增強ssDI的基因。該篩選發現了蛋白賴氨酸甲基轉移酶（PKMT）SETDB1:ATF7IP異二聚體及其下游的人類沉默中樞（HUSH）復合物是ssDI的強力負調控因子。與它們已知的生物學效應一致，SETDB1/ATF7IP和HUSH對ssDI的負調控作用對轉基因報告基因和一個HUSH調控的單拷貝基因具有特異性，而在其他（非HUSH調控的）單拷貝內源基因座中并未觀察到。
這些實驗總體上強調了染色質修飾因子——進而延伸至染色質結構——對PGE結果的深遠影響。具體來說，研究者確定了當靶標是轉基因時，SETDB1/ATF7IP和HUSH復合物是HDR子途徑ssDI的主要負調控因子。這些實驗證明染色質可以作為遺傳重組的有效屏障，并有力地支持了將類似的染色質調節策略擴展到內源單拷貝基因座以提高PGE效率的可行性。
方法
本研究使用了多種細胞系，包括單倍體人類細胞系HAP1和人類結直腸癌細胞系HCT116。研究人員構建了多種報告系統來評估ssDI效率：
- 1.
HAP1全基因組篩選細胞系：通過piggyBac轉座子和CRISPR/Cas9介導的基因靶向，在HAP1細胞中構建了一個可誘導表達Cas9并整合了雙藥物報告基因（Blasticidin和IMPDH，均被雙終止密碼子失活）的系統。
- 2.
HCT116驗證細胞系：在HCT116細胞的HPRT1基因座整合了一個GFP-P2A-失活mCherry報告基因。隨后利用CRISPR/Cas9敲除了候選基因（SETDB1、ATF7IP、MPP8、PPHLN1、TASOR、MORC2、EHMT2和SUV39H1），并建立了相應的回復突變細胞系。
- 3.
內源基因報告系統：在HCT116細胞中，通過ssDI在PIGA和CD81基因中引入失活突變，創建了內源基因報告系統。同時，在HCT116細胞的PCDHGB2（一個已知的HUSH調控基因）中引入了失活突變。
全基因組CRISPR敲除篩選：在構建的HAP1報告細胞系中，用Brunello全基因組sgRNA文庫進行感染，隨后通過誘導Cas9表達進行基因敲除。然后分兩輪進行ssDI介導的藥物（BSD和MPA）篩選，以富集那些敲除后能增強ssDI效率的基因對應的sgRNA。通過深度測序和生物信息學分析，鑒定出富集的基因。
ssDI效率評估：對于轉基因報告基因（如mCherry校正），通過流式細胞術測量校正后表達熒光蛋白的細胞比例。對于內源基因報告系統（如PIGA），使用熒光標記的Aerolysin（FLAER）染色和流式細胞術進行功能篩選。對于PCDHGB2位點的編輯效率，則通過下一代測序（NGS）進行精確定量。
基因表達分析：使用RT-qPCR技術檢測SETDB1/ATF7IP缺失對報告基因（BSD/IMPDH）以及內源HUSH調控基因（PCDHGB2）表達水平的影響。
結果
全基因組篩選發現ssDI的負調控因子
為了識別調控ssDI的基因，研究者在單倍體人類細胞系HAP1中進行了全基因組CRISPR/Cas9敲除篩選。篩選策略如圖2和圖3所示。研究者構建了一個含有可誘導Cas9表達系統和整合在AAVS1安全港位點的雙藥物報告基因（BSD和IMPDH，均因雙終止密碼子失活）的HAP1細胞系。感染Brunello sgRNA文庫后，通過兩輪連續的ssDI介導的藥物（BSD和MPA）篩選，富集那些在基因缺失時能增強ssDI的細胞克隆。對最終存活細胞的sgRNA進行測序和分析，發現SETDB1:ATF7IP異二聚體是ssDI最顯著的負調控因子之一（圖4）。此外，HUSH復合物的部分成員（MPP8和PPHLN1）也在篩選中被弱富集，提示該通路可能參與調控。
SETDB1:ATF7IP及HUSH復合物驗證為轉基因報告基因ssDI的負調控因子
為了驗證篩選結果，研究者在HCT116細胞中構建了獨立的GFP-失活mCherry報告系統。通過CRISPR/Cas9分別敲除SETDB1、ATF7IP、HUSH復合物成員（MPP8、PPHLN1、TASOR、MORC2）以及其他H3K9me3甲基轉移酶（EHMT2、SUV39H1）。ssDI校正實驗表明，SETDB1或ATF7IP敲除細胞的校正效率比野生型細胞高3-5倍（圖5A, B）。回復SETDB1或ATF7IP表達能顯著降低ssDI效率，證實了表型的特異性。同樣，HUSH復合物成員敲除也導致ssDI效率類似程度（約3倍）的提升。而敲除EHMT2或SUV39H1則未影響ssDI效率，表明SETDB1:ATF7IP/HUSH通路對ssDI的調控具有特異性。
SETDB1:ATF7IP調控HUSH調控的內源單拷貝基因的ssDI
已知SETDB1:ATF7IP/HUSH復合物也調控少數內源單拷貝基因（如一些免疫和神經調節基因）。研究者選擇了其中之一——原鈣粘蛋白γ亞家族B2（PCDHGB2）進行驗證。RT-qPCR證實，在HCT116細胞中敲除SETDB1可導致PCDHGB2mRNA表達水平大幅升高（約20倍）。研究者隨后在野生型和SETDB1敲除的HCT116細胞背景下，于PCDHGB2基因中引入了相同的失活突變，并進行了ssDI校正。NGS定量分析顯示，在SETDB1缺失的細胞中，PCDHGB2位點的ssDI編輯頻率顯著提高（約2倍）（圖6A）。這表明SETDB1:ATF7IP/HUSH通路不僅負調控轉基因的ssDI，也負調控其天然靶基因的ssDI。
SETDB1:ATF7IP不調控非HUSH靶標的內源基因ssDI
有趣的是，研究者觀察到在SETDB1、ATF7IP或HUSH成員缺失的細胞中，整合的報告基因（GFP或BSD/IMPDH）表達水平顯著增強（圖7，RT-qPCR證實提升5-6倍）。這提示，對這些轉基因和PCDHGB2的ssDI效率提升，可能源于SETDB1/ATF7IP缺失導致的局部染色質狀態從抑制性（異染色質）向允許性（常染色質）轉變。為了檢驗這一假設，研究者評估了SETDB1/ATF7IP缺失對兩個非HUSH調控的內源基因（PIGA和CD81）ssDI效率的影響。通過功能篩選（FLAER染色或流式細胞術）和NGS定量分析，發現無論是在克隆細胞系還是混合細胞群中，敲除SETDB1或ATF7IP均未顯著改變PIGA或CD81位點的ssDI效率（圖6B-D）。這表明SETDB1:ATF7IP/HUSH通路對ssDI的負調控作用具有位點特異性，主要針對其天然調控的轉基因或內源基因座。
結論
本研究通過全基因組篩選，首次將組蛋白甲基轉移酶復合物SETDB1:ATF7IP及其下游效應復合物HUSH鑒定為HDR子途徑ssDI的關鍵負調控因子。這種調控具有顯著的靶點特異性：SETDB1/ATF7IP的缺失能顯著提升其在轉基因報告基因和HUSH調控的內源單拷貝基因（如PCDHGB2）上的ssDI效率，但對于非其調控靶標的內源基因（如PIGA和CD81）則無影響。機制上，這種效應很可能與SETDB1/ATF7IP催化產生的H3K9三甲基化（H3K9me3）修飾有關，該修飾招募HUSH復合物形成抑制性染色質環境，從而阻礙了基于ODN供體的ssDI修復途徑。
這項研究具有重要意義：它從概念上證明了局部染色質環境是精確基因組編輯，特別是ssDI途徑的關鍵決定因素。研究結果提示，通過干預特定的染色質修飾因子（如抑制SETDB1/ATF7IP或HUSH復合物的功能），可以作為一種調節策略，有選擇性地提升在難編輯的異染色質區域或特定表觀遺傳調控位點進行PGE的效率，為下一代基因治療和功能基因組學研究提供了新的思路。
