《Advanced Science》：Dual-Key Genetic Circuit Enables Stable and Self-Regulated Engineered Bacteria for the Treatment of Ulcerative Colitis
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本研究報道了一種創新的“雙鑰”基因回路設計，通過在工程菌中構建依賴雙質粒補償的生存機制，成功實現了無抗生素條件下的質粒穩定、可控的細菌群體裂解以及治療蛋白的持續遞送，為潰瘍性結腸炎等免疫黏膜疾病的活菌療法提供了安全、穩定且可編程的新策略。
引言：工程菌療法的挑戰與創新
潰瘍性結腸炎是一種慢性、復發性胃腸道疾病，傳統療法難以解決其核心的免疫失衡、屏障功能障礙和腸道菌群失調問題。大腸桿菌尼氏1917作為一種公認安全的益生菌，是工程化改造的理想底盤，可用于遞送治療性基因或合成功能分子。然而，在體內代謝壓力下，工程菌中的質粒容易丟失，導致療效下降�，F有的質粒穩定策略，如使用抗生素或基于單基因缺陷的平衡致死系統，往往存在破壞腸道菌群、誘導耐藥性或長期有效性不足等局限。為此，本研究旨在開發一種無需抗生素、能實現質粒穩定、精確種群控制和持續治療蛋白分泌的新型工程菌系統。
雙鑰基因回路的設計與構建
研究的核心是建立一個合成的“雙鑰”基因回路。研究團隊利用λ-Red重組技術，敲除了EcN基因組中的asd和thyA基因，構建了雙營養缺陷型底盤菌株EcNΔasdΔthyA。asd基因編碼DAP合成的關鍵酶，其缺失會導致革蘭氏陰性菌細胞壁缺陷和快速裂解；thyA編碼胸苷酸合成酶，其缺失會損害DNA復制，導致細胞死亡。這意味著改造后的菌株自身無法獨立存活，其生存嚴格依賴于同時引入兩個分別補償這兩種缺陷的質粒，即“雙鑰”設計。
其中一個質粒是“裂解模塊”，它恢復了asd功能，并整合了基于LuxI/R的群體感應系統，用于自我調控裂解和控制蛋白釋放（“一鍵”）。該系統在細菌定植達到臨界密度時，會啟動噬菌體裂解基因?X174E的表達，使工程菌發生程序性裂解，脈沖式釋放功能蛋白。另一個質粒是“表達模塊”，它補償了thyA功能，并共遞送了治療性蛋白：一種白細胞介素-2突變體（IL-2 mut）和來自阿克曼氏菌的膜蛋白Amuc_1100（“雙鑰”）。這種設計確保了只有在兩個質粒同時存在時，工程菌才能存活并表達功能蛋白（“開”狀態）；任一質粒丟失都會導致細菌死亡（“關”狀態），從而在無抗生素條件下實現了極高的質粒穩定性。此外，研究還利用CRISPR/Cas9技術消除了EcN中內源性質粒pMUT1和pMUT2，以增強外源基因的表達。
治療蛋白的功能與選擇
針對潰瘍性結腸炎的免疫失衡和屏障損傷兩大核心問題，研究選擇了兩種治療蛋白。IL-2是調節性T細胞生存和功能的關鍵因子，但高濃度的野生型IL-2會非選擇性激活效應T細胞和自然殺傷細胞，導致全身免疫激活。為此，研究采用了IL-2突變體，其上的N103R和V106D突變可特異性降低與受體CD122的親和力，從而選擇性地激活高表達CD25的Tregs，避免副作用。計算模擬（MutaBind2和AlphaFold2）證實了這些突變能顯著降低與CD122的結合能。
Amuc_1100則能增強腸道上皮細胞緊密連接蛋白的表達，從而修復和強化腸道屏障。這兩個蛋白被共同構建在表達質粒上，實現了對免疫調節和屏障修復的雙重干預。
工程菌的修飾與體內遞送
為保護口服的工程菌免受胃酸破壞，研究采用腸溶材料L100-55對細菌進行包被。這種材料在胃的酸性環境中保持完整，在腸道的近中性環境中溶解，從而實現了細菌的靶向遞送和釋放。體外實驗表明，L100包被能有效保護細菌在模擬胃酸中的活性。體內生物發光成像也證實，包被后的工程菌能更有效地定植于腸道。
體外功能驗證與體內療效評估
體外實驗證實，該雙鑰工程菌系統能周期性地生長和裂解，并持續釋放功能蛋白。從工程菌裂解上清中收集的蛋白，在細胞實驗中顯示出明確的生物學功能：IL-2突變體能特異性促進脾臟Tregs的擴增，而不激活效應T細胞；Amuc_1100能增強腸上皮細胞Caco-2中緊密連接蛋白ZO-1的表達，并降低單層細胞的通透性。這些結果證明了工程菌釋放的蛋白具備預期的免疫調節和屏障修復功能。
在葡聚糖硫酸鈉誘導的小鼠潰瘍性結腸炎模型中，口服給予最終的工程菌制劑能顯著緩解疾病癥狀，包括減輕體重下降、降低疾病活動指數、促進結腸長度恢復、減少組織損傷。FITC-葡聚糖灌注實驗表明，治療顯著降低了結腸通透性，說明腸道屏障功能得到修復。組織學分析和免疫熒光染色進一步顯示，治療促進了結腸組織中黏液蛋白MUC2以及緊密連接蛋白Occludin和ZO-1的表達，證實了屏障修復效果。
免疫調節機制與菌群調控
在免疫機制層面，工程菌治療顯著增加了結腸固有層中Tregs的數量，同時減少了中性粒細胞等促炎免疫細胞的浸潤。結腸組織中促炎細胞因子腫瘤壞死因子-α和白細胞介素-6的水平下降，而抗炎細胞因子轉化生長因子-β和白細胞介素-10的水平上升。髓過氧化物酶活性降低，CD8+T細胞浸潤減少，這些都表明結腸組織的炎癥得到有效抑制，免疫平衡得以恢復。
此外，工程菌治療還能調節紊亂的腸道菌群。16S rDNA測序分析表明，治療部分逆轉了DSS誘導的菌群失調，抑制了促炎菌屬，并恢復了有益菌如乳桿菌的豐度，有助于重建健康的腸道微環境。
生物安全性與討論
生物安全性評估顯示，工程菌治療未引起小鼠血清生化、血常規的顯著異常，也未在主要器官造成病理損傷，表明其具有良好的生物相容性。本研究構建的雙鑰基因回路系統，通過將細菌生存與雙質粒補償嚴格耦合，并結合群體感應裂解模塊，實現了無需抗生素的質粒長期穩定、精確的細菌種群控制以及治療蛋白的按需釋放。該系統通過協同遞送IL-2突變體和Amuc_1100，同時針對潰瘍性結腸炎的免疫失衡和屏障損傷進行干預，在動物模型中顯示出顯著療效。這種模塊化、可編程的設計思路，不僅為潰瘍性結腸炎的治療提供了新策略，也為擴展工程菌療法至其他免疫和黏膜疾病奠定了堅實基礎。
