《Neoplasia》：A novel microprotein MUCP1 promotes colorectal cancer metabolic reprogramming by regulating mitochondrial succinate transport
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本論文聚焦于結直腸癌(CRC)中代謝重編程的分子調控機制這一關鍵科學問題。研究人員針對長鏈非編碼RNA(lncRNA)編碼的功能性微蛋白這一新興領域，揭示了lncRNA MUC20-OT1編碼的微蛋白MUCP1在CRC中的重要作用。研究發現，MUCP1定位于線粒體外膜，通過促進SLC25A10介導的線粒體琥珀酸(succinate)外排，進而增強H3K4me3組蛋白修飾，從而激活谷氨酰胺(glutamine)代謝相關基因的轉錄，最終維持CRC細胞的高代謝需求與惡性進展。這項工作不僅鑒定了一個全新的lncRNA編碼的致癌微蛋白，更為理解腫瘤代謝與表觀遺傳的偶聯機制提供了新視角，并提示MUCP1可能成為CRC治療的潛在代謝脆弱性靶點。
在癌癥研究的復雜圖景中，結直腸癌(Colorectal Cancer, CRC)因其高發病率和死亡率而備受關注。科學家們早已發現，癌細胞為了滿足其瘋狂增殖的需求，會對其內部的代謝網絡進行徹底的“改造升級”，這一過程被稱為代謝重編程。然而，驅動這一復雜過程的幕后“調控者”究竟是誰，許多細節仍籠罩在迷霧之中。近年來，一類曾被視為“基因組暗物質”的長鏈非編碼RNA(Long Non-coding RNA, lncRNA)逐漸走到舞臺中央，它們被發現能在多個層面調控腫瘤的進展。更令人驚訝的是，一些被標注為“非編碼”的lncRNA，實際上暗藏玄機，能夠翻譯生成具有重要功能的微小蛋白質或肽段。這些“微蛋白”如同潛藏的特工，在細胞代謝等關鍵生命活動中扮演著不為人知卻至關重要的角色。那么，在結直腸癌中，是否存在這樣的lncRNA編碼的微蛋白？它們又是如何精細調控腫瘤的代謝，從而推動癌癥發展的呢？發表在《Neoplasia》上的這項研究，為我們揭開了冰山一角。
為了探尋答案，研究團隊展開了一項系統性研究。他們首先整合了多組學數據，篩選出具有編碼潛力的lncRNA MUC20-OT1作為候選對象。隨后，通過構建融合報告基因質粒、質譜分析和免疫印跡等技術，確證了其編碼一個新型微蛋白，并將其命名為MUCP1。進一步的細胞分餾和免疫熒光實驗揭示了MUCP1定位于線粒體外膜。為了探究MUCP1的生物學功能，研究人員運用了包括細胞增殖與侵襲實驗、異種移植瘤模型在內的功能學分析。同時，他們通過非靶向和靶向代謝組學、穩定同位素13C5-谷氨酰胺示蹤、亞細胞琥珀酸定量等技術，深入剖析了MUCP1對細胞代謝的影響。此外，研究還采用了CUT&Tag和染色質免疫共沉淀-定量PCR(ChIP-qPCR)等技術，來探究MUCP1是否通過表觀遺傳機制發揮作用。免疫共沉淀(Co-IP)與質譜聯用則被用于尋找MUCP1的相互作用蛋白。本研究使用的CRC細胞系和患者配對腫瘤組織樣本均來源于公共庫或南京醫科大學附屬南京第一醫院，并經倫理委員會批準。
研究結果
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鑒定CRC中具有編碼潛力的lncRNA
通過對公共核糖體測序數據的整合分析，并結合編碼潛力評分（phyloCSF和CPAT），研究人員將目光鎖定在lncRNA MUC20-OT1上。生物信息學分析顯示，其潛在的編碼產物與琥珀酸脫氫酶黃素蛋白亞基(Succinate Dehydrogenase Flavoprotein Subunit A, SDHA)具有高度序列相似性，暗示其可能參與代謝調控。
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lncRNA MUC20-OT1編碼一個微蛋白
研究人員通過構建綠色熒光蛋白(GFP)和FLAG標簽的融合質粒，并突變其預測的開放閱讀框(Open Reading Frame, ORF)起始密碼子進行對照實驗，在細胞中成功驗證了MUC20-OT1能夠翻譯產生一個微蛋白。他們進一步利用CRISPR/Cas9技術在基因組水平實現了對該蛋白C端的FLAG標簽內源敲入，最終確證了這個由144個氨基酸組成的新型微蛋白的存在，并將其命名為MUCP1。
- 3.
MUCP1是定位于線粒體外膜的內源蛋白
細胞分餾實驗和免疫熒光共定位分析表明，MUCP1特異性地定位于線粒體。進一步的蛋白質酶K消化實驗和碳酸鈉提取實驗證實，MUCP1是一個整合在線粒體外膜上的蛋白。在多種CRC細胞系和臨床腫瘤組織中，MUCP1的表達水平均顯著高于正常對照。
- 4.
MUCP1作為致癌微蛋白維持CRC進展
功能實驗表明，敲低MUCP1能顯著抑制CRC細胞的增殖、遷移和侵襲能力。而在MUCP1敲低的細胞中重新導入有功能的MUCP1（而非起始密碼子突變體），則可以回救這些惡性表型。動物實驗也證明，穩定敲低MUCP1的CRC細胞形成的移植瘤生長受到明顯抑制。這些結果說明MUCP1本身具有促進腫瘤的致癌功能。
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MUCP1缺失破壞CRC細胞的代謝穩態
代謝組學分析發現，敲低MUCP1導致細胞內谷氨酰胺及其衍生物、以及琥珀酸等三羧酸循環(TCA cycle)中間產物的水平顯著下降，同時細胞對培養基中谷胱甘肽等物質的攝取增加。穩定同位素示蹤顯示，MUCP1缺失嚴重削弱了谷氨酰胺注入TCA循環的通量。這表明MUCP1對維持CRC細胞，尤其是谷氨酰胺代謝穩態至關重要。
- 6.
MUCP1缺失通過降低琥珀酸驅動的H3K4me3修飾抑制谷氨酰胺利用
機制探索發現，MUCP1敲低導致細胞內特別是線粒體外琥珀酸水平下降，并伴隨組蛋白H3第4位賴氨酸的三甲基化(H3K4me3)修飾水平降低。CUT&Tag和ChIP-qPCR分析證實，關鍵谷氨酰胺代謝酶（如GLS1, GLUL）以及MUC20-OT1自身基因的啟動子區H3K4me3修飾富集度下降。補充可穿透細胞的琥珀酸類似物（二乙基琥珀酸，Diethyl Succinate, DES）或組蛋白去甲基化酶KDM5抑制劑KDOAM-25，可以恢復H3K4me3水平并促進谷氨酰胺攝取。這揭示了一條MUCP1-琥珀酸-H3K4me3-谷氨酰胺代謝基因轉錄的正反饋調控軸。
- 7.
MUCP1缺失導致琥珀酸在線粒體內積累
對線粒體和胞質組分的分別定量顯示，敲低MUCP1后，琥珀酸在線粒體內異常積累，而胞質琥珀酸減少。動態監測發現，這種線粒體琥珀酸淤積與細胞內谷氨酰胺的消耗下降在時間上相關聯，提示MUCP1功能缺失損害了線粒體琥珀酸的外排。
- 8.
MUCP1對琥珀酸水平敏感并與SLC25A10協同調控琥珀酸穩態
免疫共沉淀實驗鑒定出線粒體內膜琥珀酸轉運蛋白SLC25A10是MUCP1的相互作用蛋白。兩者在表達上相互影響，功能上協同：敲低任一都會導致線粒體琥珀酸外排受阻、胞質琥珀酸減少和H3K4me3水平下降。有趣的是，MUCP1對胞內琥珀酸水平的波動反應更為迅速和敏感。當用DES增加胞質琥珀酸時，MUCP1和SLC25A10表達均上調；而當用抑制劑阻斷琥珀酸轉運或生成時，兩者的蛋白水平則會下降。這表明MUCP1可能作為一個琥珀酸感受器，與SLC25A10協同工作，精細調節線粒體琥珀酸的轉運以應對代謝需求。
研究結論與意義
本研究系統性地鑒定并驗證了一個由lncRNA MUC20-OT1編碼的全新微蛋白MUCP1。該蛋白在CRC中高表達，并定位在線粒體外膜。其核心功能是作為線粒體琥珀酸轉運的輔助調節器，通過與內膜轉運蛋白SLC25A10協作，促進線粒體基質中生成的琥珀酸向胞質運輸。胞質琥珀酸的積累進而抑制組蛋白去甲基化酶活性，提高H3K4me3修飾水平，從而激活包括其自身基因MUC20-OT1在內的谷氨酰胺代謝相關基因的轉錄。這形成了一個正反饋循環：MUCP1促進琥珀酸外排和表觀遺傳激活，增強的谷氨酰胺代謝又為琥珀酸生成提供了底物，共同維持了CRC細胞的高代謝狀態和惡性進展。
這項研究的重大意義在于多個層面：首先，它拓寬了人們對lncRNA功能的認識，證明其可通過編碼功能性微蛋白直接參與腫瘤代謝調控。其次，它揭示了一種連接線粒體代謝、代謝物轉運與核內表觀遺傳修飾的新型分子橋梁，即“MUCP1-琥珀酸-H3K4me3”軸，為理解腫瘤代謝重編程與表觀遺傳重塑的偶聯機制提供了全新范式。最后，MUCP1在CRC中特異性高表達且對其代謝穩態至關重要，這使其成為一個極具潛力的診斷生物標志物和干預靶點。針對MUCP1或其調控通路，未來可能開發出基于代謝脆弱性的新型結直腸癌治療策略。該研究啟示我們，基因組中仍大量存在的未注釋微蛋白，是發現癌癥關鍵調控因子和療法新靶點的寶貴資源。
