《New Biotechnology》：Reporter based screening identifies small molecule CBL0137 as an enhancer of CRISPR cytosine base editor and prime editor via p53 activation and NF-κB inhibition
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為解決CRISPR胞嘧啶堿基編輯器（CBE）和先導編輯器（PE）在難編輯位點效率低下的難題，研究人員利用CBE響應的GFP報告系統高通量篩選了174個靶向DNA損傷、細胞周期和凋亡通路的小分子。他們鑒定出CBL0137可顯著提升CBE的內源位點編輯效率（最高達80%），并選擇性增強PE介導的多點突變和片段插入。該研究為通過調控細胞通路（p53/NF-κB）選擇性增強基因編輯工具效率提供了新策略，提升了其治療轉化潛力。
在基因治療和生命科學研究領域，CRISPR/Cas9系統及其衍生物——堿基編輯器（Base Editors, BEs）和先導編輯器（Prime Editors, PEs）——帶來了革命性的變化。它們能夠在不引入DNA雙鏈斷裂的情況下實現精準的基因組編輯，極大地降低了因DNA斷裂導致的染色體異常等風險，為治療遺傳病帶來了前所未有的希望。然而，這些“基因剪刀”的“編輯效率”卻參差不齊，特別是在一些染色質結構致密、難以接近的基因組位點，編輯成功率常常不盡如人意，成為其走向臨床應用的“卡脖子”難題。為了提高效率，科學家們嘗試了多種方法，包括改造編輯器本身或利用小分子藥物來調控細胞內的修復機制。那么，是否存在一種“增效劑”，能夠安全、有效地提升這些編輯工具在難治位點的表現呢？
由Yun Hu、Yanhong Wang、Siyuan Wang、Yaoge Jiao、Rui Tao、Shaohua Yao（通訊作者）組成的四川大學華西醫院研究團隊在《New Biotechnology》上發表的研究，給出了一個肯定的答案。他們通過巧妙的實驗設計，篩選出一種名為CBL0137的小分子化合物，發現它能夠通過激活著名的“基因組守護神”p53通路并抑制炎癥相關通路NF-κB，來選擇性且顯著地增強特定類型的基因編輯，為解決編輯效率瓶頸提供了全新的策略。
為了開展這項研究，作者團隊主要運用了幾項關鍵技術。首先，他們構建了一個巧妙的“基因編輯效率傳感器”——基于Tol2轉座子系統的穩定整合GFP報告細胞系（eGFP(202S)-293T）。這個報告系統包含一個因點突變而失活的綠色熒光蛋白（eGFP），只有當CBE成功將其糾正回正常序列時，細胞才會發出綠色熒光，從而實現對CBE活性的快速、定量、高通量檢測。利用該系統，他們對一個包含174個小分子的內部化合物庫（靶向DNA損傷、細胞周期和凋亡通路）進行了篩選。其次，研究廣泛使用了下一代測序（NGS）和桑格測序，對內源性基因組位點的編輯效率、產物純度（如C-to-T與C-to-G的比例）以及脫靶效應進行了精準量化。此外，為了探究機制，他們使用了特定的通路激動劑（如Nutlin-3a、Tenovin-6）和抑制劑（如BAY11-7082、BAY11-7085），并結合了過表達顯性負性p53突變體等分子生物學手段，來剖析CBL0137的作用機理。最后，研究還采用了正交R-loop實驗來評估Cas9非依賴性的脫靶編輯。
研究結果
2.1. 高通量篩選鑒定出增強CBE的候選小分子
研究人員構建了可由CBE激活的GFP報告系統，并建立了穩定的報告細胞系eGFP(202S)-293T。利用該系統對174個小分子進行篩選后，發現CBL0137的效果最為顯著，能將報告系統的編輯信號增強約5.5倍。劑量優化實驗確定其最佳工作濃度為0.5 μM，能在有效增強編輯的同時保持細胞活力。
2.2. CBL0137增強內源位點CBE的效率和純度
在HEK293T細胞中，CBL0137處理能顯著提高BE3在9個內源靶點中7個位點的C-to-T編輯效率，平均提升約50%。同時，它還明顯降低了不純的C-to-G編輯產物。在包括異染色質區域（如NF1）、高甲基化位點（MSSK1）和治療相關靶點（如HBG1/2）在內的6個難編輯位點，CBL0137也一致性地提高了編輯效率，平均提升約40%。這種增強效果在其他CBE變體（BE3-A3A, BE3-AID）以及其他細胞系（HeLa, LO2）中也得到驗證。此外，結構類似的化合物奎納克林（quinacrine）也表現出類似的增強C-to-T、降低C-to-G的效果。與已報道的組蛋白去乙酰化酶抑制劑（HDACi）Nexturastat A相比，CBL0137的增強效果相當，兩者聯用可進一步優化編輯結果，獲得最高的C-to-T純度和編輯效率。脫靶分析表明，CBL0137會輕度增加Cas9依賴的脫靶編輯，但不影響Cas9非依賴的脫靶編輯。
2.3. p53激活和NF-κB抑制共同貢獻了CBL0137對CBE的增強作用
機制研究表明，CBL0137是一種多靶點化合物，已知可通過靶向FACT復合物來激活p53并抑制核因子κB（NF-κB）。通過使用p53通路激活劑（Nutlin-3a, Tenovin-6）和NF-κB通路抑制劑（BAY11-7082, BAY11-7085），研究人員發現單獨激活p53或抑制NF-κB均能增強CBE效率。而過表達顯性負性p53突變體（p53 R175H, p53 DD）則會抑制CBE效率。聯合使用p53激活劑和NF-κB抑制劑的效果優于單一化合物。這些結果證實，p53激活和NF-κB抑制共同介導了CBL0137對CBE的增強作用。
2.4. CBL0137對其他堿基編輯器的影響
研究評估了CBL0137對其他類型堿基編輯器的影響。結果發現，它對腺嘌呤堿基編輯器（ABE）的效率有輕微降低或沒有影響。對于依賴于脫嘌呤/脫嘧啶（AP）位點修復的編輯器，如腺嘌呤顛換編輯器（AYBE）、基于糖基化酶的鳥嘌呤堿基編輯器（gGBE）和C-to-G堿基編輯器（CGBE），CBL0137的影響因位點而異，總體表現為效率輕微下降或無顯著變化。這表明CBL0137的作用具有編輯類型和位點特異性，提示不同堿基編輯誘導的DNA損傷可能通過不同機制修復。
2.5. CBL0137對各類先導編輯的影響
令人驚訝的是，CBL0137對PE的影響呈現出選擇性。它輕微降低了PE介導的單點突變效率，但卻顯著增強了PE介導的多點突變（提升19%-205%）和小片段插入（提升54%-266%）的效率，而對片段刪除的效率影響不明確。這種增強效果在LO2細胞中也得到重復。機制上，p53激活劑和NF-κB抑制劑同樣能增強PE的多點突變和片段插入效率，說明CBL0137對PE的增強也通過相同通路實現。研究人員推測，PE介導的插入和刪除可能產生不同的DNA中間體，從而招募不同的修復因子，導致CBL0137產生差異化的效果。
研究結論與意義
本研究成功建立了一個高效的CBE報告系統，并利用其篩選出小分子化合物CBL0137作為CBE和特定類型PE的強效增強劑。CBL0137不僅能提升CBE的編輯效率和產物純度，其效果與已知的增強劑Nexturastat A相當，兩者聯用更能協同優化編輯結果。更重要的是，研究發現CBL0137能選擇性增強PE介導的多點突變和片段插入，這為需要同時修正多個突變或插入治療性基因片段的疾病（如某些遺傳病）提供了新的工具優化思路。
研究的核心發現是，CBL0137通過激活p53通路和抑制NF-κB通路來發揮增強作用。值得注意的是，在HEK293T等體細胞中，p53的激活促進了編輯，這與之前在誘導多能干細胞（iPSCs）中的研究發現（抑制p53可增強編輯）相反。這凸顯了p53通路在響應DNA損傷時具有細胞類型特異性的功能，為未來針對不同細胞類型設計編輯增強策略提供了重要見解。
此外，CBL0137對CBE有增強作用，但對結構相似僅缺少尿嘧啶-DNA糖基化酶抑制劑（UGI）的CGBE影響甚微，提示其增強作用依賴于內源UNG活性，可能通過p53調控的DNA修復網絡來實現。而對PE編輯類型的選擇性增強則暗示，不同長度和類型的PE編輯可能產生結構各異的DNA中間體，并經由不同的修復通路完成，CBL0137對這些通路的影響存在差異。
綜上所述，該工作不僅為提高CBE和PE的編輯效率提供了一種實用的小分子策略，有望推動這些下一代基因編輯工具的臨床轉化，還為了解不同基因組編輯器所誘導DNA損傷的修復機制提供了新的線索。通過操控p53和NF-κB這類關鍵的細胞信號通路來“定制化”增強基因編輯，代表了一條極具潛力的研究方向。
