目的：有氧糖酵解在肝細胞癌（HCC）的增殖、轉移和免疫抑制中至關重要。本研究建立HCC小鼠模型，旨在探索電針和艾灸是否可通過抑制NSUN2介導的有氧糖酵解來緩解HCC小鼠病情。

方法：通過腹腔注射二乙基亞硝胺（DEN）聯合四氯化碳（CCl₄）建立HCC小鼠模型。在艾灸組和電針組，選取雙側“肝俞”（BL18）和“足三里”（ST36）穴位進行干預。采用酶聯免疫吸附法（ELISA）定量血清標志物水平。通過免疫組化（IHC）、蛋白質印跡法（Western blotting）和實時定量PCR（qRT-PCR）評估有氧糖酵解相關蛋白和mRNA的表達。采用基于MRM的靶向代謝組學量化肝臟能量代謝改變。

結果：在建模第28周完成后，肉眼觀察顯示明顯的肝臟腫大伴形態扭曲。肝表面粗糙不規則，相鄰肝葉間存在不同程度的粘連。值得注意的是，肝臟實質中散在分布著外觀呈白色或暗紅色、邊界清晰的大腫瘤。經過總計26周的干預，與模型組相比，電針和艾灸顯著降低了肝臟腫瘤數量、腫瘤負荷、平均腫瘤直徑和腫瘤體積（P< 0.05）。此外，脾臟指數和肝臟指數也顯著降低（P< 0.05）。治療后，血清甲胎蛋白（AFP）及其異質體AFP-L3的蛋白水平顯著下降（P< 0.05）。NSUN2和PKM2的蛋白及mRNA表達水平顯著下調（P< 0.01）。與糖酵解通量受到抑制一致，己糖激酶2（HK2）的蛋白表達也顯著降低（P< 0.001）。同時，艾灸降低了肝臟中早期糖酵解中間產物葡萄糖-6-磷酸（G6P）和果糖-6-磷酸（F6P）的含量（P< 0.01），而電針僅降低了G6P水平（P< 0.001）。相反，糖酵解最后一步之前的高能中間產物磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的水平則顯著升高（P< 0.001）。

結論：本研究揭示，電針和艾灸均通過抑制NSUN2-PKM2糖酵解軸來減輕HCC小鼠的腫瘤增殖，從而凸顯該通路作為非藥物干預的新型代謝靶點；此外，艾灸獨特地展現出誘導更廣泛代謝應激反應的潛力。觀察到的腫瘤負荷和關鍵生物標志物的減少證實了該方法的治療潛力。這些臨床前研究結果共同表明，電針和艾灸作為非藥物輔助療法，在調節腫瘤代謝和延緩HCC進展方面具有轉化潛力，值得進一步的臨床研究。

肝細胞癌（HCC）是全球癌癥相關死亡的第三大原因。肝癌細胞經歷廣泛的代謝重編程，其特征是增強的有氧糖酵解、上調的從頭脂肪生成和加速的氨基酸代謝，這些共同為其快速增殖、侵襲和轉移提供必要的能量、還原當量和生物合成前體。有氧糖酵解在HCC的增殖、轉移、免疫抑制和耐藥性中起關鍵作用，其過程的改善依賴于糖酵解酶的表達和活性，并與HCC的預后密切相關。己糖激酶2（HK2）、磷酸果糖激酶1（PFK1）和丙酮酸激酶M2型（PKM2）是糖酵解過程中的關鍵催化酶。

NOP2/Sun結構域家族成員2（NSUN2）介導m5C表觀遺傳修飾，與多種癌癥的發生發展密切相關。先前的研究已確定，NSUN2介導的m5C超甲基化通過靶向下游效應子PKM2來增強HCC的有氧代謝。大量臨床和臨床前研究探索了針灸在肝癌中的治療或姑息作用。電針和艾灸雖然都植根于傳統穴位刺激，但代表了兩種不同的物理模式，具有潛在不同的主要作用機制。電針通過脈沖電流，主要經體感神經通路轉導，以調節全身神經內分泌和炎癥反應。艾灸則通過燃燒艾絨產生的局部熱量和生物活性化合物，可能通過激活熱敏受體和直接藥理調節局部組織發揮作用。

鑒于HCC的代謝失調受神經信號和局部炎癥微環境的雙重影響，本研究旨在對這兩種干預措施進行比較性研究。在晚期肝纖維化和肝硬化患者中，近90%最終會發展為肝細胞癌。因此，本研究采用DEN聯合CCl₄誘導的HCC小鼠模型來模擬肝臟中炎癥向癌癥的轉變。通過聚焦于NSUN2介導的糖酵解，本研究旨在探討艾灸和電針在預防和治療HCC中的效果和機制。

動物實驗與試劑：使用雄性C57BL/6J小鼠。

HCC模型建立：根據先前研究，通過腹腔注射DEN和CCl₄制備HCC模型。

盲法與操作標準化：為確保完全分離隨機化、實驗程序和評估，由三名不同的研究者參與。

分組與干預：小鼠隨機分為四組：正常組（NG）、模型組（MG）、艾灸組（MOX）和電針組（EA）。艾灸組和電針組選取雙側“肝俞”（BL18）和“足三里”（ST36）穴位進行干預。電針組連接電針儀進行刺激。干預每周三次，持續26周。

樣本收集與處理：干預結束后，采集血液和肝臟、脾臟組織，進行觀察、稱重和保存。

酶聯免疫吸附試驗（ELISA）：檢測血清中AFP和AFP-L3水平。

腫瘤增殖、脾臟和肝臟指數：計算腫瘤體積、負荷、數量、平均直徑/體積，以及脾臟指數和肝臟指數。

蘇木精-伊紅（H&E）染色：觀察肝臟組織形態。

免疫組織化學（IHC）：檢測肝臟組織中NSUN2和PKM2的蛋白表達。

RNA分離與實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）：評估NSUN2、NSUN6、PKM2的mRNA表達水平。

蛋白質印跡法（Western Blotting）：檢測NSUN2、HK2和乳酸脫氫酶A（LDHA）的蛋白表達水平。

靶向代謝組學：采用超高效液相色譜系統結合質譜分析，量化肝臟組織中糖酵解相關代謝產物的含量。

統計分析：使用SPSS和GraphPad Prism軟件進行數據分析。

肉眼觀察顯示，模型組小鼠肝臟表面粗糙不平，有許多大小不一的顆粒狀圓形突起，局部有白色或暗紅色腫瘤，腫瘤遍布血管。與模型組相比，艾灸組和電針組的肝臟腫瘤數量、腫瘤負荷、腫瘤平均直徑和平均體積均顯著減小，且血管較少。

H&E染色顯示，模型組肝索和肝竇結構破壞，中央靜脈移位，腫瘤邊界不清，伴有嚴重的肝細胞空泡化和廣泛的炎癥細胞浸潤。艾灸組和電針組基本保留了正常的肝臟結構，盡管部分細胞質可見小空泡，并觀察到壞死和再生肝細胞簇。

模型組小鼠的脾臟指數和肝臟指數顯著高于正常組，艾灸后脾臟指數顯著下降。同時，模型組血清AFP和AFP-L3含量顯著高于正常組，而艾灸和電針干預后兩者含量均顯著降低。這些結果表明，艾灸和電針可以降低小鼠脾臟指數，抑制AFP和AFP-L3的表達，從而在HCC進展過程中延緩腫瘤增殖。

免疫組化結果顯示，與正常組相比，模型組NSUN2和PKM2蛋白表達顯著升高。與模型組相比，艾灸組和電針組中NSUN2和PKM2的表達降低。

qRT-PCR結果顯示，模型組NSUN2和PKM2的mRNA表達升高，而艾灸和電針干預后其表達下降。然而，NSUN6的mRNA水平無統計學差異。

質控標準顯示代謝物具有良好的色譜分離效果。所有樣本等量混合制備質控（QC）樣本，其相對標準偏差（RSD）小于30%，表明數據穩定可靠。

熱圖顯示了正常組與模型組、模型組與電針組、模型組與艾灸組之間肝臟糖酵解相關代謝產物的差異。

對肝臟組織中糖酵解相關代謝產物的分析顯示，與正常組相比，模型組中G6P、F6P、鳥苷-5‘-單磷酸（GMP）和腺苷一磷酸（AMP）的相對含量顯著增加，而3-磷酸-D-甘油酸（3PG）和PEP的相對含量降低。與模型組相比，艾灸和電針干預后，G6P和AMP的相對含量下降，而PEP含量升高。同時，艾灸還能額外降低F6P和GMP的相對含量。

蛋白質印跡分析結果顯示，模型組中NSUN2和HK2的蛋白表達顯著增加，而艾灸和電針干預后其表達下降。

然而，LDHA的蛋白水平無統計學差異。

由于缺乏高特異性和敏感性的早期診斷生物標志物，加上HCC固有的高轉移潛能，其患者總體生存率仍然極低。HCC是炎癥驅動癌變的典型例子。本研究使用的DEN聯合CCl₄誘導的小鼠模型，再現了肝臟中炎癥向癌癥的轉變，是HCC研究的經典模型。

HCC的治療選擇多樣且取決于分期。近年來，針灸和艾灸常與其他療法結合用于治療HCC，在抑制腫瘤生長、減輕不良反應、緩解臨床癥狀、提高生活質量和延長生存期方面顯示出優勢。作為補充和替代療法，針灸和艾灸在HCC中顯示出雙重臨床益處：增強鎮痛和減少藥物副作用，同時通過免疫調節發揮抗腫瘤作用。

從中醫理論看，肝癌的發展與肝脾腎虛、氣滯濕熱瘀毒有關。“足三里”（ST36）是足陽明胃經的合穴和胃的下合穴，是健脾要穴。“肝俞”（BL18）是基于“臟病取背俞”的治療原則。研究表明，針刺“足三里”可抑制H22肝癌小鼠的腫瘤細胞生長。艾灸“肝俞”和“足三里”可通過調節Wnt信號通路有效減少癌細胞增殖。

脾臟指數是機體免疫狀態的重要指標。本研究中治療后脾臟指數的降低表明，電針和艾灸可能改善脾臟功能并調節全身免疫反應，這可能與其觀察到的抗腫瘤作用有關。同時，干預后肝葉粘連程度、肝臟指數顯著降低，肝臟腫瘤數量、負荷、平均直徑和體積均小于模型組，這表明艾灸和電針可以抑制HCC腫瘤的生長。

AFP是HCC監測和診斷中最常見的血清檢測方法，但其診斷敏感性較低。因此，AFP通常與其他血清生物標志物聯合使用。AFP-L3可以提高HCC診斷的特異性，是新一代HCC診斷標志物。本研究顯示，模型組血清AFP和AFP-L3蛋白含量顯著高于正常組，而艾灸和電針治療后兩種蛋白含量顯著低于模型組，這表明艾灸和電針均改善了HCC小鼠的肝功能。

研究表明，NSUN2敲除可抑制HCC的細胞過程和腫瘤生長。本研究發現，與模型組相比，艾灸和電針干預后肝臟組織中NSUN2的蛋白和mRNA水平顯著降低。這表明艾灸和電針干預可能通過抑制NSUN2的表達來影響HCC的發展。

癌癥由代謝異質性的細胞組成。葡萄糖代謝是生命活動的主要能量來源，在癌癥發展中起著關鍵作用。即使在氧氣充足的情況下，癌細胞也優先利用糖酵解途徑并產生乳酸，這種現象被稱為“瓦博格效應”（Warburg Effect）。HK2是葡萄糖進入細胞后參與葡萄糖代謝的第一個限速酶，在HCC組織中高表達。PFK1參與催化G6P轉化為F6P并隨后轉化為果糖-1,6-二磷酸的過程。PKM2是糖酵解途徑的末端酶，在HCC中上調并與不良預后相關，它通過催化PEP和ADP轉化為丙酮酸和ATP來增強瓦博格效應，促進HCC的發生和轉移。

本研究利用靶向代謝組學分析組間糖酵解代謝物的差異，發現G6P、F6P和PEP存在顯著變化。與正常組相比，模型組肝臟組織中G6P和F6P的相對水平升高，而艾灸降低了G6P和F6P的水平，電針降低了G6P水平。這些發現表明，艾灸和電針可能增加葡萄糖攝取，導致G6P和F6P水平降低。在模型組中觀察到PEP水平下降，PKM2蛋白和mRNA表達升高，以及HK2蛋白表達升高。相比之下，艾灸和電針干預提高了PEP水平，同時降低了PKM2蛋白和mRNA表達以及HK2蛋白表達。總之，這些結果表明，艾灸和電針可能抑制糖酵解末端酶PKM2，從而減少PEP消耗，影響乳酸產生，最終抑制HCC中的糖酵解過程。

盡管電針和艾灸作用于相同的穴位，但它們通過不同的初始信號機制影響HCC進展。本研究發現，兩種干預措施都匯聚于抑制NSUN2-PKM2糖酵解軸，表明在抑制HCC方面，它們可能共享一個共同的下游代謝調控節點。然而，對每種干預措施改變的代謝譜進行更深入的分析發現，艾灸表現出更廣泛的代謝調節能力，影響了包括G6P、F6P、PEP、GMP和AMP在內的一系列代謝物。這表明艾灸可能誘導更全面的代謝重編程和能量應激反應。而電針對F6P和GMP的調節沒有顯示出明顯效果，表明其對代謝網絡的影響可能更為集中，但仍足以有效抑制核心通路。未來研究需要進一步闡明這兩種模式之間的具體機制差異。

本研究存在一些局限性。機制結論主要依賴于艾灸/電針與NSUN2/PKM2水平降低之間的相關性觀察，缺乏直接的功能驗證。缺乏假針刺對照組使得區分特異性治療效果與非特異性生理反應變得復雜。未來的研究應納入遺傳或藥理學干預、嚴格的控制組和臨床研究，以加強這些發現的機制和治療意義。

關于與當前療法結合的未來方向。雖然經動脈化療栓塞（TACE）和免疫檢查點抑制劑（ICIs）已成為中晚期HCC的關鍵治療方法，但其臨床應用受到已知限制的制約。TACE后的缺血缺氧可能加劇腫瘤微環境內的免疫抑制，并可能引發“反彈侵襲”生長模式，而ICIs的療效常因HCC中的治療相關不良事件而受限。本研究揭示的機制表明，針灸可以干預TACE后殘余腫瘤細胞的代謝重編程，為抑制侵襲性進展提供了理論基礎，并展示了其免疫調節潛力。未來的研究應側重于評估針灸聯合TACE對客觀緩解率、無進展生存期和生活質量的影響，以及考察針灸聯合免疫療法對腫瘤免疫微環境、治療反應率和不良事件特征的影響。通過推進基于機制的臨床研究，針灸和艾灸有望成為HCC多學科管理中一個有價值的整合組成部分。

總之，這些發現闡明，盡管電針和艾灸具有不同的生物物理性質，但它們都通過抑制NSUN2介導的糖酵解來抑制HCC的發生和進展，其中艾灸可能誘導更廣泛的代謝應激反應。這些發現不僅為觀察到的針灸對癌癥患者（如改善生活質量和癥狀控制）的臨床益處提供了機制基礎，而且為潛在的聯合治療照亮了轉化橋梁。雖然提供的相關性證據有力地支持了這一機制，但要確定因果關系，未來仍需通過拯救實驗進行功能驗證。用針灸靶向NSUN2-PKM2代謝-表觀遺傳節點，可能提供一種新的輔助策略，以增強當前標準HCC治療的療效或減少其副作用，值得進一步的臨床研究。

本研究使用動物的方案經上海中醫藥大學動物倫理委員會批準。

所有作者均對報告的工作做出了重大貢獻。

作者報告在本工作中無利益沖突。

支持本文結論的數據集可由通訊作者提供。