腎移植是治療終末期腎病患者最有效的方法。然而，移植后早期移植物功能恢復和長期生存仍然是臨床實踐中的核心問題（Nishio Lucar等人，2024年）。移植物功能延遲（DGF）尤其是急性排斥反應是影響預后的關鍵因素，其管理依賴于對 tubular 損傷的及時識別和干預（Tabernero等人，2023年；Yarlagadda等人，2009年）。腎損傷分子-1（KIM-1）是一種跨膜蛋白，在受損的近端小管中特異性上調并釋放到尿液中，已成為評估腎損傷和修復過程的潛在生物標志物（Van Timmeren等人，2007年；Zhang等人，2008年）。與血清肌酐等傳統標志物相比，尿液中KIM-1濃度的變化能更早、更直接地反映小管壓力，為臨床決策提供了關鍵的治療窗口（Aldea等人，2025年；Zhang和Pafikh，2019年）。然而，由于缺乏合適的檢測方法，其集成到常規診斷中受到了阻礙（Cai等人，2019年；Jackcy等人，2020年）。盡管已經采用了多種傳統技術（包括酶聯免疫吸附測定法（ELISA）、電化學方法和表面等離子共振（SPR）來檢測KIM-1），但這些方法存在一些局限性，如檢測時間較長、需要復雜且昂貴的光學儀器，以及對低分子量蛋白質的靈敏度較低（Das等人，2023年；Seitkamal等人，2025年）。因此，開發一種結合高靈敏度、高特異性和操作簡便性的新型KIM-1檢測策略對于優化移植后管理和改善患者預后具有重要意義。

近年來，包含規律間隔短回文重復序列及其相關蛋白的CRISPR/Cas系統作為一種強大的信號放大工具而脫穎而出，因為它具有出色的目標基因識別能力。利用其DNase/RNase活性，該系統已在傳感和檢測領域得到廣泛應用（Zhu等人，2023年）。特別是Class 2 CRISPR系統（包括Cas12、Cas13和Cas14a）已成為下一代分子診斷的關鍵工具（Li等人，2022a；Sun等人，2023年）。這些系統中crRNA的可編程特性使得能夠精確識別和切割順式和反式目標DNA或RNA，從而便于在光學檢測方法中實現信號讀出，并實現高靈敏度的目標識別。在Class 2 CRISPR系統中，Cas12a蛋白因其更簡單的crRNA設計、更高的特異性和更廣泛的應用性而被廣泛用于核酸生物傳感（Liu等人，2024年）。然而，與非核酸目標的檢測相比，這一領域仍處于早期階段，并面臨多重挑戰。適配體是通過指數富集（SELEX）技術系統進化選擇的單鏈寡核苷酸，它們表現出與抗體相當的高特異性和親和力，同時具有易于化學合成和修飾、可編程的序列和結構、低毒性和免疫原性以及高化學穩定性，使其成為生物傳感應用的理想識別元件（Zhao等人，2021年）。通過作為識別和轉導元件，適配體與目標的結合事件可以直接轉化為CRISPR-Cas介導的切割作用在報告探針上，從而反映目標的濃度變化。基于這一原理，已經開發出基于CRISPR/Cas的通用適配體傳感器，能夠高效靈敏地檢測各種非核酸分析物（Geng等人，2025年；Zhao等人，2024年；Zhang等人，2024年；Zhu等人，2024年）。在基于CRISPR/Cas的適配體傳感器中，常用的信號探針是熒光團-淬滅劑標記的單鏈DNA，通過這種方式，目標信號可以轉化為實時、高靈敏度的熒光信號。為了擴展這些適配體傳感器在多種應用場景中的適用性，研究人員基于不同的信號讀出模式開發了各種報告探針，如SERS探針（Li等人，2022b；Zhuang等人，2022年）、基于個人血糖儀的探針（Chen等人，2023年）和電化學探針（Han等人，2022年；Xu等人，2025年）。

納米酶通常被定義為具有內在酶樣特性的納米材料，由于其出色的穩定性、高催化效率和易于功能化，在生物傳感器的開發中得到了廣泛應用（Hong等人，2024年；Liang等人，2019年）。Broto及其同事提出了一種基于CRISPR Cas與納米酶連接的檢測方法，用于無需擴增的非編碼RNA檢測（Broto等人，2022年），其中設計良好的納米酶作為信號催化劑，提高了Cas介導檢測的靈敏度，消除了對前端擴增的需求。這種方法稱為CRISPR-Zyme，由于其簡單性和直接可視化讀數特性，為即時檢測提供了可行的解決方案。因此，納米酶被證明是通過催化底物轉化生成可檢測信號的有希望的候選者。在此基礎上，Hou的研究小組將具有高過氧化物酶活性的Fe-N-C單原子納米酶與CRISPR/Cas12a系統結合，開發出一種高靈敏度和特異性的比色適配體傳感器，用于檢測黃曲霉素B1（Liu等人，2024年）。盡管獲得了令人滿意的檢測結果，但主要依賴于單一信號輸出模式，尤其是比色模式。比色方法簡單易用，但其相對較低的靈敏度以及易受樣品基質干擾和主觀解釋的影響，對其在復雜生物樣本中定量微量蛋白質的準確性和可靠性構成了挑戰。因此，為了擴大CRISPR-nano酶系統的應用范圍，需要朝著開發雙重或多重信號輸出策略的方向進行戰略轉變。這種具有內部自驗證能力和強大抗干擾性能的先進設計對于提高該方法的整體穩健性和發揮其全部臨床潛力至關重要。

因此，本文提出了一種新的雙重讀數檢測系統，用于高效準確地定量KIM-1，該系統利用適配體、CRISPR Cas12a系統和FeNi MOF@AgNPs納米酶的協同作用（圖1）。通過毛細管電泳（CE）SELEX和系統截短獲得了高親和力和高特異性的KIM-1適配體。同時合成了具有高過氧化物酶活性的FeNi MOF@AgNPs納米酶，并對其催化機制進行了徹底研究。這種適配體被巧妙設計為CRISPR/Cas12a系統的分子開關：KIM-1與適配體的結合有效抑制了Cas12a/crRNA復合物的切割活性，隨后未被抑制的Cas12a會切割特制的底物探針（FeNi MOF@AgNPs-MBs）。經過磁分離后，釋放的FeNi MOF@AgNPs納米酶可以產生兩種不同的信號：比色信號來自納米酶的POD樣催化活性，在H₂O₂存在下氧化TMB，導致吸光度變化；熒光信號則是通過用NaOH處理納米酶使其NH₂-BDC脫質子化而產生的（Li等人，2023年；Lv等人，2018年）。所開發的適配體傳感器表現出優異的準確性、選擇性和靈敏度，并成功應用于術后八天內動態追蹤腎移植受者的尿液KIM-1水平。這項研究不僅為KIM-1的檢測提供了強大的工具，還為將基于CRISPR的方法擴展到精確檢測蛋白質建立了通用策略。