環(huán)狀RNA（circRNAs）是一類獨特的非編碼分子，通過非典型的反剪接事件從前體mRNA外顯子中產(chǎn)生。這種合成途徑導致它們具有共價閉合的拓撲結構，使其在結構上不同于線性同源異構體（Sanger等人，1976年；Qu等人，2015年；Petkovic等人，2015年）。與線性RNA不同，circRNAs具有保守的反剪接接頭（BSJ）位點，并且對RNase具有抗性（Jeck等人，2014年）。作為細胞過程的重要調(diào)節(jié)因子，circRNAs因其多種功能而受到關注，包括作為強效microRNA（miRNA）拮抗劑、介導基因轉(zhuǎn)錄/RNA剪接控制以及與各種RNA結合蛋白（RBPs）形成復合物（Hansen等人，2013年；Memczak等人，2013年）。circRNAs已被證明通過多種機制在調(diào)節(jié)腫瘤細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和藥物耐藥性方面發(fā)揮關鍵作用（Wang等人，2021年；Yu等人，2022年；Ge等人，2021年；Jiang等人，2024年）。circRNAs的異常表達與多種病理狀況有關，包括癌癥（Conn等人，2024年）、神經(jīng)退行性疾病（Kondo等人，2020年）和心血管疾病（Mei等人，2022年）。因此，circRNAs成為非侵入性生物標志物檢測和癌癥直接治療調(diào)節(jié)的有希望的候選者。

現(xiàn)有的circRNA檢測方法如Northern印跡（Khandjian等人，1986年）、微陣列（Jiang等人，2024年）、熒光原位雜交（FISH）（Yu等人，2022年）和RNA測序（Puri等人，2023年）存在某些局限性。這些方法通常涉及復雜的多步驟協(xié)議，需要大量時間和高成本的分析設備及專業(yè)人才。這些限制阻礙了這些方法在臨床中的廣泛應用。因此，迫切需要開發(fā)更高效和靈敏的circRNA檢測方法，以加深對其生物學特性和作為各種疾病生物標志物潛力的理解。然而，線性RNA的干擾以及circRNAs的微量存在給檢測帶來了困難。

CRISPR/Cas系統(tǒng)由具有核酸酶活性的Cas效應蛋白及其相應的引導RNA（gRNA/crRNA）組成。該復合體需要原間隔序列（PAM）來識別特定序列的目標并實現(xiàn)初始結合（Hille等人，2018年；Zetsche等人，2015年；Fonfara等人，2016年）。在Cas-crRNA復合體成功捕獲目標后，CRISPR-Cas效應蛋白激活非特異性內(nèi)切酶功能。這種獨特的輔助活性導致相鄰單鏈DNA（ssDNA）報告分子的切割，使該系統(tǒng)成為核酸（DNA/RNA）診斷的強大平臺（East-Seletsky等人，2016年）。然而，單獨使用CRISPR-Cas12a對于精確檢測微量circRNAs的靈敏度不足，因此需要整合核酸擴增過程以提高靈敏度（Chen等人，2021年）。

等溫擴增方法，如滾環(huán)擴增（RCA）（Liu等人，2020年；Wang等人，2023年）、環(huán)介導的等溫擴增（LAMP）（Song等人，2022年；Li等人，2023年）、鏈置換擴增（SDA）（Wu等人，2024年）和重組酶聚合酶擴增（RPA）（Zhao等人，2023年），受到了廣泛關注。這些方法能夠在單一恒定溫度下高效擴增目標DNA或RNA，無需復雜的熱循環(huán)過程。盡管在一定程度上有效，但這些方法常常受到非特異性擴增、復雜的設計要求和反應機制的困擾，促使人們探索性能更優(yōu)的替代方法。基于等溫擴增的circRNA檢測方法應優(yōu)先考慮靈敏度、用戶友好性和成本效益。在這種背景下，雜交鏈反應（HCR）提供了一個有吸引力的替代方案，其特點是等溫、無需酶且擴增速度快（Chu等人，2019年）。HCR依賴于兩個或多個發(fā)夾DNA探針之間的級聯(lián)雜交。引入特定觸發(fā)分子后，HCR促進雙鏈DNA（dsDNA）串聯(lián)體的自主生長。這種形成線性dsDNA產(chǎn)物的能力使該反應在核酸信號增強應用中具有廣泛用途。結合HCR的無酶擴增功能和CRISPR/Cas系統(tǒng)的卓越特異性，HCR和CRISPR/Cas系統(tǒng)成為一種有前景的策略。研究表明，這種組合方法對于識別多種目標（包括細胞外囊泡、miRNA-21和沙門氏菌）有效（Xing等人，2020年；Long等人，2024年；Qiao等人，2023年）。

在本研究中，我們通過集成一種高度特異性的趾扣依賴型捕獲探針-啟動子鏈雙鏈結構，增強了該檢測系統(tǒng)，從而實現(xiàn)對circRNAs的精確識別。這種方法利用了趾扣介導的鏈置換的熱力學優(yōu)勢，作為后續(xù)HCR和CRISPR-Cas12a擴增級聯(lián)反應的強大啟動器。特別是，高效的反應載體對于通過特定捕獲探針實現(xiàn)目標分子的精確識別和富集至關重要。金屬有機框架（MOFs）是通過金屬離子/簇與有機配體的強鍵驅(qū)動自組裝形成的多孔三維晶體材料（Furukawa等人，2013年；Zhou等人，2014年）。將功能化磁性納米顆粒（MNPs）與MOFs結合制備磁性金屬有機框架（MMOFs）在固液相分離和生物分子富集方面受到了更多關注，因為它們易于分散、孔隙率高、吸附能力強、超順磁性和較大的表面積與體積比（Li等人，2023年；Zhou等人，2025年）。在此，我們開發(fā)了一種多功能磁性MOF復合體（Fe₃O₄-Au@UIO-66-NH₂）作為趾扣探針的載體。氨基功能化的UiO-66（UiO-66-NH₂）框架提供了高密度、生物相容的微環(huán)境，保護趾扣探針免受復雜生物基質(zhì)中的核酸酶降解，并降低了趾扣介導的鏈置換的活化能。在Fe₃O₄@UIO-66-NH₂上修飾的Au納米顆粒（AuNPs）通過Au-S共價鍵提高趾扣探針的裝載效率，同時穩(wěn)定趾扣依賴型捕獲探針，從而增強其分子識別能力和結構完整性。

最終，我們開發(fā)了一種基于Fe₃O₄-Au@UIO-66-NH₂@趾扣探針介導的HCR和CRISPR-Cas12a系統(tǒng)的超靈敏檢測circ_0051240的方法。鑒于當前circRNA檢測的局限性和挑戰(zhàn)，我們的方法不是簡單的技術堆疊，而是一種基于組分之間內(nèi)在生化關聯(lián)和熱力學一致性的合理架構設計。通過優(yōu)化生物界面和分子識別動力學，我們建立了一種穩(wěn)健的分析范式，其根本創(chuàng)新體現(xiàn)在以下幾個方面：首先，設計了適應拓撲結構的磺化趾扣依賴型捕獲探針-啟動子鏈雙鏈結構，以特異性識別circRNA的BSJ。所得circRNA-探針雜交體比初始雙鏈具有更負的Gibbs自由能（ΔG），為有效的鏈置換提供了強大的熱力學驅(qū)動力。該雙鏈結構實現(xiàn)了精確高效的BSJ結合，同時最小化了與線性RNA的非特異性相互作用。其次，磺化趾扣-H0雙鏈與Fe₃O₄-Au@UIO-66-NH₂復合體的共價連接通過Au-S和Zr-O-P鍵確保了circRNA結合時啟動子鏈（H0）的受控釋放。這種獨特架構促進了固液界面上的快速鏈置換反應，有效降低了BSJ特異性識別所需的活化能。此外，F(xiàn)e₃O₄的整合不僅實現(xiàn)了快速磁富集，還使反應組分在受限的納米空間內(nèi)預濃縮。這種設計避免了自由趾扣探針系統(tǒng)中觀察到的H0過早釋放，顯著減少了不必要的HCR啟動產(chǎn)生的背景信號。第三，HCR系統(tǒng)被設計為生成具有最佳間距和高密度CRISPR識別基序的dsDNA串聯(lián)體。這種基序排列最大化了CRISPR-Cas12a的轉(zhuǎn)切割活性，促進了Cas12a-sgRNA復合體與dsDNA產(chǎn)物的有效結合，實現(xiàn)了協(xié)同擴增效應，超過了單獨使用HCR和CRISPR-Cas12a系統(tǒng)的疊加效果。總體而言，本研究提出了一種創(chuàng)新的分析策略，利用界面工程指導MOF輔助CRISPR生物傳感器的合理設計，適用于精準腫瘤學應用。