《Journal of Animal Science and Biotechnology》：Iron deficiency aggravates hepatic inflammation in suckling piglets via endoplasmic reticulum stress-driven NF-κB pathway activation
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本研究發(fā)現(xiàn)，在哺乳仔豬模型中，缺鐵（ID）通過誘發(fā)氧化還原失衡、抑制核心的Nrf2/HO-1抗氧化信號通路，從而引發(fā)肝臟氧化應(yīng)激。這進一步激活了未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）的PERK/IRE1α分支，導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）。ERS進而驅(qū)動TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的激活，造成促炎與抗炎細胞因子失衡，最終加劇肝臟炎癥損傷。該研究為缺鐵相關(guān)性肝損傷提供了新的分子機制見解。
引言
鐵是維持人類和動物生長發(fā)育不可或缺的微量元素，參與氧氣運輸、細胞信號轉(zhuǎn)導、能量代謝穩(wěn)態(tài)和免疫防御等多種生理過程。然而，鐵缺乏癥（ID）仍然是全球范圍內(nèi)最普遍的營養(yǎng)性疾病。在養(yǎng)豬生產(chǎn)中，新生仔豬先天性鐵儲備低，生長迅速，而母乳鐵含量不足，加之現(xiàn)代遺傳育種技術(shù)導致的窩產(chǎn)仔數(shù)增加、常規(guī)補鐵方案的技術(shù)缺陷等因素，共同加劇了新生仔豬缺鐵性貧血（IDA）的發(fā)生率，導致生長遲緩、腹瀉、氧化應(yīng)激和免疫缺陷等臨床問題。
肝臟是鐵儲存和代謝的主要器官，也是關(guān)鍵的免疫樞紐。然而，現(xiàn)有研究多集中于ID對腸道、脾臟和外周血免疫細胞的影響，其對哺乳仔豬肝臟炎癥的分子機制尚不明確。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）是負責維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵細胞器。在缺鐵等病理條件下，蛋白質(zhì)折疊保真度受損，導致錯誤折疊或未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)積累，從而引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS），激活未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）。ERS已成為連接營養(yǎng)缺乏與組織病理學的關(guān)鍵節(jié)點。本研究旨在利用哺乳仔豬模型，探究ID誘導肝臟ERS和炎癥的機制，為完善補鐵策略和設(shè)計靶向療法提供分子層面的理論依據(jù)。
材料與方法
本研究采用了體內(nèi)和體外模型。動物實驗經(jīng)南京農(nóng)業(yè)大學動物倫理委員會批準。選取同期分娩的仔豬，隨機分為正常對照組（NC）和缺鐵組（ID）。NC組在出生后第3天和第14天肌肉注射右旋糖酐鐵，ID組注射磷酸鹽緩沖鹽水（PBS），兩組均飼喂缺鐵配方奶。在21日齡時取樣分析。
細胞實驗使用AML12小鼠肝細胞系。通過添加鐵螯合劑去鐵胺（DFO）誘導體外缺鐵模型。使用ERS抑制劑4-苯基丁酸（4-PBA）進行干預(yù)。
檢測指標包括：肝臟鐵含量、氧化應(yīng)激標志物（8-羥基脫氧鳥苷、丙二醛MDA、總超氧化物歧化酶T-SOD、過氧化氫酶CAT、谷胱甘肽過氧化物酶GSH-PX、還原型谷胱甘肽GSH）、促炎與抗炎細胞因子（IL-1β、TNF-α等）、ERS/UPR通路相關(guān)蛋白（GRP78、p-PERK、p-IRE1α、ATF4、CHOP等）以及TLR4/NF-κB通路相關(guān)蛋白（MYD88、p-IκBα、p-NF-κB p65等）。采用組織病理學（H&E染色）、透射電鏡（TEM）、RNA測序（RNA-seq）、實時定量PCR（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)印跡（Western blot）等技術(shù)進行分析。
結(jié)果
1. 缺鐵破壞哺乳仔豬肝臟鐵代謝并誘導氧化應(yīng)激
與NC組相比，ID組仔豬肝臟鐵含量和鐵儲存核心蛋白鐵蛋白重鏈（FTH）的表達均顯著降低。編碼鐵調(diào)節(jié)激素hepcidin的HAMP mRNA表達也顯著下調(diào)，證實了缺鐵仔豬模型構(gòu)建成功。ID導致肝臟氧化應(yīng)激生物標志物8-OHdG水平顯著升高，同時抗氧化酶T-SOD、CAT和GSH-PX的活性分別降低了37.1%、35.7%和40.5%，而脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA的含量增加了2.7倍。在基因水平上，ID顯著下調(diào)了抗氧化和氧化還原相關(guān)基因（如NRF2、SOD1、CAT、GPX1、HMOX1）的mRNA表達，并上調(diào)了KEAP1的表達。這些結(jié)果表明，ID通過破壞Nrf2-Keap1抗氧化防御系統(tǒng)，導致仔豬肝臟氧化還原失衡和氧化損傷。
2. 缺鐵通過UPR激活誘導哺乳仔豬肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激
組織病理學分析顯示，ID組仔豬肝臟出現(xiàn)肝索紊亂、細胞質(zhì)空泡化、水腫變性和單核炎性細胞浸潤。透射電鏡進一步顯示，ID組肝細胞核膜收縮，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（RER）數(shù)量減少且池擴張、核糖體脫落。與這些結(jié)構(gòu)破壞一致，ID組肝臟中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78的蛋白水平顯著上調(diào)。同時，UPR傳感器PERK（Thr980）和IRE1α（Ser724）的磷酸化水平顯著增加，而總ATF6表達不變，表明UPR主要通過PERK和IRE1α分支激活。促凋亡轉(zhuǎn)錄因子ATF4及其下游靶點CHOP的蛋白水平也顯著升高，證實ERS通過ATF4-CHOP軸驅(qū)動肝細胞凋亡。
3. 缺鐵誘導哺乳仔豬肝臟炎癥并激活TLR4/NF-κB通路
RNA-seq分析表明，ID組仔豬肝臟中免疫相關(guān)通路（如細胞因子產(chǎn)生、趨化因子信號通路、Toll樣受體信號通路）顯著富集。與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致，ID組肝臟中IL-1β和TNF-α的含量顯著增加。M2型巨噬細胞標志物和抗炎細胞因子的mRNA表達下調(diào)，而M1型巨噬細胞標志物和促炎細胞因子的mRNA表達上調(diào)。在機制上，ID組肝臟中TLR4、MYD88和RELA（編碼NF-κB p65亞基）的mRNA表達顯著增加，而NFKBIA（編碼IκBα）的表達降低。在蛋白水平上，MYD88的表達以及NF-κB p65和IκBα的磷酸化比例均顯著增加。這些結(jié)果表明，ID通過激活TLR4/NF-κB信號軸促進仔豬肝臟炎性損傷。
4. 缺鐵在肝細胞中誘導炎癥和ERS
在AML12肝細胞中，DFO誘導的缺鐵同樣重現(xiàn)了上述表型的關(guān)鍵特征。ID顯著上調(diào)了促炎基因的表達，下調(diào)了抗炎基因的表達。TLR4/NF-κB信號軸被激活，表現(xiàn)為MYD88表達上調(diào)和IκBα、NF-κB p65磷酸化增強。同時，ERS也被誘導，表現(xiàn)為GRP78、ATF4、CHOP蛋白上調(diào)以及PERK和IRE1α磷酸化增加。這些體外結(jié)果與體內(nèi)觀察結(jié)果高度一致。
5. ERS誘導炎癥反應(yīng)和NF-κB通路激活
為了探究ERS在ID誘導炎癥中的因果作用，在AML12細胞中使用了ERS抑制劑4-PBA。4-PBA預(yù)處理顯著降低了DFO誘導的ERS標志物（GRP78、p-PERK、ATF4、p-IRE1α）的上調(diào)。同時，4-PBA減輕了ID的促炎效應(yīng)，下調(diào)了促炎細胞因子的表達，上調(diào)了抗炎細胞因子IL10的表達。更重要的是，4-PBA介導的ERS抑制減弱了ID誘導的NF-κB通路過度激活，顯著降低了IκBα和NF-κB p65的磷酸化水平。這些數(shù)據(jù)從機制上表明，在鐵缺乏條件下，ERS是肝細胞炎癥的重要上游驅(qū)動因素，而NF-κB信號級聯(lián)是關(guān)鍵的下游執(zhí)行者。
討論
本研究揭示了ID通過氧化應(yīng)激觸發(fā)的ERS啟動肝臟損傷的惡性循環(huán)。具體而言，ID損害了電子傳遞鏈功能和鐵依賴性抗氧化酶，導致活性氧積累并抑制了Nrf2通路。這種氧化負擔激活了UPR的PERK和IRE1α分支，進而促進NF-κB介導的促炎細胞因子轉(zhuǎn)錄。研究建立了一個“氧化應(yīng)激-ERS-炎癥”的自我放大循環(huán)模型。
鐵作為關(guān)鍵電子傳遞鏈輔因子（如鐵硫簇和細胞色素）的重要組成部分，其缺乏會破壞鐵硫簇合成并損害細胞色素功能，從而降低電子傳遞鏈效率，增加活性氧生成。本研究中，缺鐵仔豬肝臟抗氧化酶活性下調(diào)，Nrf2/Keap1-HO-1信號軸功能受損，共同導致抗氧化能力嚴重削弱。
肝臟免疫平衡的破壞是ID致肝損傷的核心。ID不僅直接損害肝細胞的蛋白翻譯效率，影響免疫球蛋白合成，還通過激活TLR4/NF-κB通路，極化了肝臟局部免疫微環(huán)境，使促炎狀態(tài)占主導。盡管炎癥本身通常誘導hepcidin上調(diào)，但在本研究中，缺鐵信號覆蓋了炎癥刺激，導致HAMP表達被抑制，這是機體增強鐵吸收和動員的適應(yīng)性策略。
ERS是連接ID與肝臟炎癥的關(guān)鍵橋梁。ID可能通過破壞鐵硫簇生物合成和細胞色素功能來損害線粒體氧化磷酸化，導致活性氧過度產(chǎn)生。同時，肝臟抗氧化酶系統(tǒng)活性下調(diào)降低了活性氧清除能力。這些效應(yīng)共同導致未折疊或錯誤折疊蛋白異常積累，最終誘導ERS。而ERS的所有三個分支（PERK、IRE1α、ATF6）均可通過不同機制與NF-κB信號形成串擾，驅(qū)動炎癥反應(yīng)。本研究中使用4-PBA抑制ERS后，NF-κB活化和炎癥均得到緩解，直接證實了ERS在其中的介導作用。此外，炎癥與ERS之間存在雙向相互作用，炎癥細胞因子亦可誘導ERS，形成正反饋環(huán)路。
結(jié)論
本研究闡明了ID導致肝損傷的一系列相互關(guān)聯(lián)的事件鏈：ID直接損害電子傳遞鏈功能，導致活性氧過度積累；ID狀態(tài)下調(diào)了鐵依賴性抗氧化酶的活性，削弱了肝臟清除活性氧的能力；ID還抑制了Nrf2信號通路，加劇了氧化應(yīng)激。這些積累的活性氧激活了由PERK和IRE1α介導的UPR通路。PERK/IRE1α軸進而激活NF-κB信號通路，觸發(fā)IL-1β和TNF-α等促炎細胞因子的釋放。這一系列反應(yīng)建立了一個“氧化應(yīng)激-ERS-炎癥”的自我擴增惡性循環(huán)，加重了肝臟損傷。該研究為開發(fā)治療哺乳仔豬缺鐵性肝損傷的靶向干預(yù)措施提供了重要的理論基礎(chǔ)。
