《Communications Biology》：A practical guide to targeted single-cell RNA sequencing technologies
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這篇綜述系統剖析了傳統3′/5′端單細胞RNA測序（scRNA-seq）在檢測目標轉錄本（TOI）和序列區域（ROI）時存在的各類偏倚，并全面介紹了靶向測序解決方案（包含捕獲、引物設計、擴增、雙重PCR、探針雜交五大類）來克服這些局限。文章為研究人員提供了實用的決策樹，助其根據實驗需求（如檢測單核苷酸變異、剪接點、融合斷點）選擇最適合的靶向方法。
單細胞RNA測序（scRNA-seq）已成為解析組織中單個細胞基因表達的強大工具。然而，當前主流的高通量3′/5′端scRNA-seq方法僅能檢測細胞中10–40%的轉錄本，且獲取的信息通常局限于轉錄本末端的非翻譯區（UTR），導致對轉錄本內部重要區域（如編碼區、突變位點）信息的丟失。這些局限性嚴重阻礙了研究者對特定目標轉錄本（Transcripts of Interest, TOIs）和序列區域（Regions of Interest, ROIs）的檢測。為此，一系列靶向scRNA-seq方法應運而生，旨在特異性富集TOIs或ROIs，以彌補標準方法的不足。
scRNA-seq中影響TOI和ROI檢測的偏倚
標準的3′/5′端scRNA-seq實驗流程會引入多種偏倚，影響TOI和ROI的檢測。這些偏倚貫穿于整個工作流程，主要可歸納為三類：scRNA-seq協議固有的偏倚、轉錄本序列特征相關的偏倚以及實驗設計選擇引入的偏倚。
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單細胞制備：組織解離、細胞分離等步驟可能損傷RNA，導致碎片化或線粒體RNA比例升高，影響TOI檢測。
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dT捕獲/引物設計與內部捕獲：大多數方法通過oligo(dT)捕獲帶poly(A)尾的mRNA，這排除了非poly(A)化的RNA（如調控RNA）。此外，分子擁擠和空間位阻會阻礙結合，而內部多聚腺苷酸化序列導致的“內部捕獲”會產生截短的cDNA，消耗珠子上有限的寡核苷酸，并導致轉錄本5′端信息丟失。
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逆轉錄：逆轉錄效率受轉錄本二級結構、高GC含量等因素影響，可能導致cDNA合成不完全或引入序列錯誤。
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模板轉換：包括“鏈入侵”（可能導致嵌合cDNA）和“scRNA-seq模板轉換”（依賴逆轉錄酶末端轉移酶活性添加非模板C，然后由模板轉換寡核苷酸TSO介導第二鏈合成）。后者效率不高，導致許多cDNA分子無法完成全長轉換。
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較短cDNA的生成：為適配短讀長測序，需通過轉座酶片段化（Tagmentation）或隨機引物法將cDNA縮短至200-600 bp。轉座酶插入有序列偏好性，隨機引物則可能導致錯配延伸。關鍵在于，cDNA必須在其末端包含細胞條形碼和唯一分子標識符（UMI），因此可讀取的序列信息通常局限在捕獲位點（polyA尾）約600 bp范圍內，這使得獲取編碼序列（CDS）內部信息變得困難。
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PCR偏倚：PCR擴增偏好短且GC含量均衡的cDNA，可能導致低豐度TOIs被高豐度cDNA掩蓋。聚合酶的保真度也影響ROI序列的準確性。
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高通量測序：測序深度直接影響低表達TOI的檢出概率。讀長決定了能否覆蓋到遠離捕獲位點的ROI。不同測序平臺（如Illumina, PacBio, ONT）具有不同的錯誤譜。
基于短讀長測序的靶向scRNA-seq策略
為克服上述偏倚，靶向方法在scRNA-seq流程的不同階段進行干預。根據其富集策略，可分為五大類：
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類別1：靶向捕獲：通過在條形碼珠上修飾與TOI內部區域互補的寡核苷酸（捕獲序列），在逆轉錄前直接從RNA池中物理捕獲目標轉錄本。代表性方法如DART-seq、RoCKseq和direct capture Perturb-seq。其優勢在于從源頭富集目標，可繞過不利于逆轉錄的區域，并能靶向非poly(A)化轉錄本。局限性包括潛在的脫靶捕獲和因RNA二級結構導致的雜交效率低下。
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類別2：靶向引物設計：使用能與轉錄本或cDNA特定區域結合的引物，來富集ROI或TOI信息。根據引物加入的步驟不同，可作用于第一鏈cDNA（如RoCK and ROI、Constellation-Seq）、逆轉錄步驟（如GoT、tss2）或擴增后的cDNA（如Constellation-Seq應用于10× Chromium文庫）。這類方法通過定義cDNA的5′端，將信息“移位”到TOI內部，有效緩解了3′/5′端偏倚，并降低了對讀長的要求。其局限性在于引物設計的特異性、潛在的非特異性結合以及RNA二級結構對引物結合的影響。
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類別3：靶向擴增：在文庫制備后期（通常在cDNA擴增后），使用針對特定ROI或TOI的引物進行額外的PCR，以富集這些區域。代表性方法包括BD Rhapsody平臺的靶向擴增模塊、TARGET-seq、BART-Seq以及GoT-Splice和scG2P方法的一部分。這類方法操作相對簡單，可靈活設計大量引物。但主要挑戰在于需與大量背景cDNA競爭，可能導致低豐度靶點富集效率不高，且無法緩解早期步驟（如捕獲、逆轉錄）引入的偏倚。
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類別4：雙重靶向PCR：在同一反應體系中，使用兩套不同的靶向引物分別擴增基因的不同區域（通常是5′UTR和3′UTR），以獲得全長或近全長的轉錄本信息。代表性方法如GoT和GoT-Splice，特別適用于將體細胞突變（位于ROI）與細胞類型（由TOI表達譜定義）進行關聯。其主要優勢是能夠獲得跨越多個外顯子的信息，有利于檢測可變剪接和突變。局限性在于需要為每個靶基因設計兩對引物，多重化程度受限，且擴增效率受兩對引物性能共同影響。
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類別5：探針雜交：使用熒光標記的DNA探針與細胞內的RNA靶點原位雜交，然后通過顯微成像或測序進行檢測。代表性方法如HyPR-seq（基于成像）和HybriSeq（基于測序）。其最大優勢是可在完全保留空間位置信息的情況下，對少量預先定義的靶點進行高靈敏度、高多重性的檢測，無需逆轉錄或擴增，避免了相關偏倚。局限性在于通量有限（通常靶點數在百個級別），且無法獲得非靶向轉錄本的全基因組表達譜。
靶向方法在長讀長測序和空間轉錄組學中的應用
靶向策略也被整合到長讀長測序（如PacBio, Oxford Nanopore）和空間轉錄組學技術中，以提升其性能。
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長讀長測序：長讀長技術能直接測序全長cDNA，但通量較低。通過結合靶向策略（如探針雜交富集scTaILoR-seq，或通過靶向引物進行特異性擴增如HIT-scISOseq），可以富集包含特定條形碼或來自目標基因的cDNA，從而提高目標序列的覆蓋深度和檢測效率。
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空間轉錄組學：許多空間轉錄組學方法本質上是靶向的，例如基于探針雜交的（如10x Genomics Visium， 其后續的靶向panel如10x Flex）或基于捕獲的（如Slide-seq）方法。這些方法通過在空間位置上捕獲特定mRNA，將基因表達信息與組織形態學背景相關聯。
選擇指南與未來展望
為幫助研究者選擇合適的靶向方法，文章提供了一個實用的決策樹。決策的關鍵因素包括：主要目標是增強TOI檢測還是ROI檢測？需要多高的細胞通量？是否需要保留標準轉錄組信息？ROI是位于轉錄本內部還是末端？預算是多少？以及實驗室具備哪些技術平臺。
未來，靶向scRNA-seq領域的發展方向可能包括：開發能夠同時靶向數千個ROI的高多重性方法；創建更靈活、可定制的“按需”靶向panel；將靶向測序與蛋白質組學、表觀基因組學等多組學技術更緊密地整合；以及利用人工智能輔助設計最優的靶向策略和數據分析流程。
總之，靶向scRNA-seq方法為克服傳統技術的偏倚提供了強大的工具箱。通過明智地選擇和運用這些方法，研究者能夠以前所未有的精度和深度，探索單細胞中特定的轉錄本和遺傳變異，從而推動基礎生物學發現和臨床醫學研究。
