在奶山羊的養殖業中，公羊的繁殖效率直接關系到種群的生產力和經濟效益。而這一切的起點，深藏于睪丸這個“生命工廠”內部。其中，有一類特殊的“保姆”細胞——支持細胞，它們是決定“工廠”產能上限的關鍵。每個成熟的支持細胞能“照料”的生殖細胞數量是有限的，因此，支持細胞的總數在動物幼年時期就已定型，這直接決定了其終身生精能力。那么，如何增加這個“保姆團隊”的初始規模，就成了提升公羊繁殖潛力的核心生物學問題。促卵泡激素是調控支持細胞功能的核心激素，但其在奶山羊這一重要經濟畜種中，如何具體促進未成熟支持細胞的增殖，其背后的分子機制是什么，科學界此前并不清楚。這構成了提升奶山羊育種效率的一個關鍵知識空白。同時，支持細胞在出生后何時停止增殖，即其關鍵的“擴編”窗口期是何時，也缺乏精確界定，這使得基于發育生物學的精準管理策略難以實施。為了解決這些問題，來自西北農林科技大學的研究團隊在《Journal of Dairy Science》上發表了一項研究，首次在反芻動物模型中系統地解答了這些疑問，揭示了促卵泡激素通過一條意想不到的信號通路驅動支持細胞增殖的精細調控機制。

為了開展這項研究，作者們綜合運用了多種關鍵技術。他們首先采集了1至4月齡關中奶山羊的睪丸組織樣本，通過組織形態學分析和免疫熒光染色，在體描繪了支持細胞的發育時間線。隨后，他們從山羊睪丸中成功分離并鑒定了高純度的原代支持細胞，建立了體外研究模型。利用細胞計數試劑盒、EdU摻入、流式細胞術等技術，在體外精確評估了促卵泡激素對細胞活力、DNA合成和細胞周期的影響。通過蛋白質印跡和實時定量PCR，檢測了增殖標志物、細胞周期蛋白以及Wnt通路關鍵分子的表達變化。研究還采用了轉錄組測序技術，對促卵泡激素處理前后的細胞進行全基因組表達譜分析，以發現富集的關鍵信號通路。最后，他們使用了特異性的Wnt/β-信號通路抑制劑KYA1797K進行功能缺失實驗，結合上述細胞學與分子生物學手段，驗證了該通路的必要性。

奶山羊睪丸支持細胞的發育：研究人員發現，從30日齡到120日齡，奶山羊睪丸重量、曲細精管直徑和管腔直徑均隨日齡增加。關鍵的免疫熒光結果顯示，在出生后90天內，睪丸組織中存在同時表達支持細胞標志物SOX9和增殖標志物PCNA的細胞，表明支持細胞在此階段仍具有增殖能力。到120日齡時，幾乎所有SOX9陽性細胞都不再表達PCNA，意味著支持細胞已經成熟并停止了增殖。定量分析進一步揭示，支持細胞中SOX9⁺/PCNA⁺的比例在60日齡達到峰值，說明此時增殖最為活躍。與此相呼應的是，血漿中的促卵泡激素水平也在60日齡顯著高于其他時期。這些結果首次精確界定了奶山羊支持細胞出生后的增殖窗口期（約30-90天），其中60日齡是增殖高峰。

促卵泡激素促進支持細胞增殖：體外實驗證實，促卵泡激素能顯著提高支持細胞的活力，其促增殖效應具有劑量和時間依賴性，1 IU/mL處理24小時效果最佳。EdU染色直接顯示促卵泡激素處理組有更多正在進行DNA合成的細胞。流式細胞術分析表明，促卵泡激素處理使處于DNA合成期的細胞比例顯著增加，處于G1期的細胞比例減少。分子機制上，促卵泡激素上調了增殖標志物PCNA、Ki-67以及一系列細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK1、CDK2、CDK4、CDK6）的表達。這些證據共同表明，促卵泡激素是奶山羊未成熟支持細胞的有效促增殖因子，它能推動細胞從G1期進入S期。

促卵泡激素促進支持細胞分泌細胞因子：除了促進自身增殖，支持細胞還為生殖細胞提供營養和支持。研究發現，促卵泡激素處理能顯著提高支持細胞中雄激素結合蛋白、膠質細胞源性神經營養因子和干細胞因子的mRNA表達水平，并增強這些蛋白在細胞培養上清液中的分泌。這三種因子對于維持局部高濃度雄激素環境、促進精原干細胞自我更新以及生殖細胞的遷移和存活至關重要，表明促卵泡激素在增加支持細胞數量的同時，也同步增強了其支持功能。

分析促卵泡激素促進支持細胞增殖的分子機制：為了探尋促卵泡激素起作用的關鍵通路，研究人員進行了轉錄組測序分析。對比促卵泡激素處理組與對照組，他們發現了561個差異表達基因。通路富集分析顯示，Wnt信號通路是其中最顯著富集的通路之一，提示該通路可能在促卵泡激素的促增殖效應中扮演重要角色。

促卵泡激素通過激活Wnt/β-信號通路促進奶山羊支持細胞增殖：后續的驗證實驗確認了上述預測。蛋白質印跡結果顯示，促卵泡激素處理上調了Wnt通路下游的關鍵靶蛋白，如細胞周期蛋白D1、c-Myc和轉錄因子TCF4的表達。為了檢驗該通路的功能必要性，研究使用了特異性的Wnt通路抑制劑KYA1797K。結果顯示，抑制Wnt通路不僅降低了細胞活力，還顯著削弱了促卵泡激素的促增殖效果。在分子水平上，抑制劑降低了β-連環蛋白和細胞周期蛋白D1的表達，而促卵泡激素的共處理可以逆轉這種抑制。這些功能喪失實驗強有力地證明，Wnt/β-信號通路的激活是促卵泡激素驅動奶山羊支持細胞增殖所必需的環節。

綜上所述，本研究得出結論：促卵泡激素是奶山羊未成熟支持細胞的關鍵促增殖因子。其作用機制在于激活了經典的Wnt/β-信號通路，從而上調細胞周期蛋白D1等靶基因，驅動細胞從G1期進入S期，最終實現細胞數量的擴增。研究首次精準描繪了奶山羊支持細胞出生后30至90天的增殖窗口，其中60日齡為活躍高峰。最重要的是，該研究首次在反芻動物模型中提供了功能性證據，證明Wnt/β-信號通路是促卵泡激素促增殖作用不可或缺的下游效應器。

在討論部分，作者強調了本研究的創新性與意義。與以往主要在嚙齒類或豬模型中研究的經典cAMP/PKA/ERK通路不同，本研究揭示了在奶山羊中，Wnt/β-信號通路作為一個關鍵且非冗余的調節模塊，與經典通路協同工作。這一物種特異性的調控特征的發現，豐富了我們對促卵泡激素作用機制的理解。從應用角度看，該研究不僅為反芻動物睪丸發育生物學提供了新的機制見解，更具有明確的育種實踐指導價值。研究所確定的支持細胞增殖關鍵窗口期，為在生產中通過外源性干預（如在60-90日齡期間進行針對性管理或營養調控）來最大化支持細胞庫的建立，從而潛在提升種公羊的精子產量和繁殖效率，提供了寶貴的理論依據和時間框架。盡管研究中使用的促卵泡激素濃度為體外有效濃度，高于生理水平，但其核心價值在于確證了這條通路的功能必要性，為未來的深入研究和應用探索奠定了堅實的基礎。