《International Journal of Genomics》：Establishment of a m6A-Related Molecular Pattern in the Prognosis and Immune Infiltration of Osteosarcoma Using Machine Learning and Experiments
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本論文（綜述）報道了一項結合機器學習（彈性網懲罰Cox回歸）與實驗驗證的前沿研究。研究團隊成功構建并驗證了一個基于14個N6-甲基腺苷（m6A）相關基因的骨肉瘤預后預測模型，該模型在訓練集、內部驗證集及外部驗證集中均展現出強大的預后區分能力。文章進一步建立了整合風險評分、年齡、性別等臨床參數的列線圖，證實該模型能顯著提高預后預測的準確性。此外，分析揭示高風險患者免疫評分降低，且與腫瘤惡性相關的通路（如E2F靶標、MYC靶標）顯著富集。通過對關鍵基因TRAP1的功能驗證，研究為骨肉瘤的預后評估及個體化治療決策提供了新的分子標志物和潛在干預靶點。
研究背景與目的
骨肉瘤是最常見的原發性惡性骨腫瘤，好發于青少年，其高轉移率和低于60%的5年生存率是臨床診療的重大挑戰。N6-甲基腺苷（m6A）是一種動態、可逆的RNA修飾，廣泛參與調控基因表達，在腫瘤發生發展中扮演關鍵角色。盡管已有多種骨肉瘤預后模型被開發，但基于m6A相關基因的預后模型尚未明確。本研究旨在利用機器學習算法，篩選并構建一個穩健的m6A相關基因預后模型，以期為骨肉瘤患者的預后分層和臨床決策提供新依據。
研究方法
研究從GEO數據庫獲取了GSE21257和GSE16091兩個骨肉瘤數據集。首先，在GSE21257數據集中篩選出與總生存期顯著相關的基因（p < 0.05），并與來自GeneCards數據庫的m6A相關基因取交集，得到110個候選基因。將GSE21257數據集的70%樣本作為訓練集，剩余30%作為內部測試集，GSE16091作為外部測試集。運用彈性網懲罰Cox回歸模型，通過最小化均方誤差確定了最優λ值（λmin），并基于此篩選出14個模型基因：CASP8AP2, DNMT1, GTF2F1, KCNK7, KRT14, LATS1, MCAM, NAV2, NIN, NNT, NR4A3, PPOX, SLC7A1, TRAP1。隨后，基于這些基因的表達水平及回歸系數，為每位患者計算風險評分，并根據中位數將患者分為高風險組和低風險組。通過接收者操作特征曲線（ROC）、Kaplan-Meier生存分析和Wilcoxon檢驗等方法，在多個數據集中驗證模型的預后預測效能。此外，結合風險分組、年齡、性別、Huvos分級（一種評估新輔助化療后腫瘤細胞壞死率的病理分級系統）和轉移狀態，構建了預測1年、3年和5年生存率的臨床列線圖。研究還利用CIBERSORT和XCELL算法進行免疫浸潤分析，并應用基因集富集分析（GSEA）探索高低風險組間的生物學通路差異。最后，通過實時定量聚合酶鏈式反應（RT-qPCR）驗證關鍵基因在骨肉瘤細胞系中的表達，并使用CRISPR/Cas9技術敲低TRAP1基因，通過CCK-8、克隆形成和細胞凋亡實驗驗證其在骨肉瘤細胞增殖和凋亡中的功能。
主要研究結果
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預后模型的構建與驗證：基于λmin值構建的14基因模型顯示出優異的預后預測能力。在訓練集、內部測試集和外部測試集中，模型的ROC曲線下面積（AUC）值分別為0.8304、0.9091和0.7123。時間依賴性ROC分析顯示，該模型預測1年、3年和5年總生存期的AUC值分別達到0.8827、0.8709和0.7664，總體AUC為0.8275。生存分析表明，高風險組患者的總生存期顯著短于低風險組。
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模型基因的驗證與功能：單因素Cox回歸分析證實了大多數模型基因與預后顯著相關，其中MCAM, NNT, SLC7A1, TRAP1被確定為風險因子，KCNK7為保護因子。實驗驗證發現，MCAM, NNT, SLC7A1, TRAP1在骨肉瘤細胞系中表達顯著上調。
- 3.
臨床列線圖的建立：包含風險分級的列線圖能夠直觀預測患者生存概率。校準曲線顯示該列線圖的預測值與實際觀測值具有良好的一致性。通過具體病例（如患者GSM531300）的對比分析證實，加入風險分級信息的列線圖比未加入的模型預測更為準確。
- 4.
免疫微環境與通路特征：免疫浸潤分析發現，在GSE21257數據集中，高風險組的M0型巨噬細胞比例增高，免疫評分降低；在GSE16091數據集中，高風險組的M2型巨噬細胞比例和免疫評分均降低。GSEA結果顯示，高風險組中多個促癌通路顯著富集并被激活，如E2F靶標、MYC靶標、有絲分裂紡錘體組裝和缺氧相關通路；而干擾素-γ應答、細胞凋亡等抑癌通路則受到抑制。
- 5.
關鍵基因TRAP1的功能驗證：功能實驗表明，敲低TRAP1基因能夠顯著抑制骨肉瘤細胞（143B和U2OS）的增殖能力（CCK-8和克隆形成實驗）并促進細胞凋亡，證實了TRAP1在驅動骨肉瘤進展中的關鍵作用。
研究結論
本研究成功運用彈性網懲罰Cox回歸模型，構建了一個基于14個m6A相關基因的骨肉瘤預后預測模型。該模型在內部及外部驗證中均表現出強大的預后區分能力，并且基于此模型構建的臨床列線圖有望輔助臨床決策。研究發現高風險骨肉瘤患者存在免疫評分降低和特定促癌通路激活的特征。特別地，通過實驗驗證了模型基因TRAP1在骨肉瘤進展中的促癌功能。這項研究不僅為骨肉瘤的預后評估提供了新的分子工具，也為開發針對m6A修飾及相關靶點（如TRAP1）的個體化治療策略奠定了理論基礎。
