《Microchemical Journal》：Rapid and sensitive detection of
fusarium graminearum in maize using an RPA–CRISPR/Cas12a system
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本研究開發了一種結合RPA與CRISPR/Cas12a的檢測平臺，用于快速、靈敏且特異地鑒定玉米中的鐮刀菌屬（F. graminearum）。該平臺通過靶向EF-1α基因，在20分鐘內可檢測低至13拷貝的DNA，且在接種后4天即可識別田間感染樣本，無需專業知識和昂貴設備，顯著優于傳統方法。
王艷芬|高旭鵬|李振康|張宏偉|王柳豪|張強|孫菲菲|周峰|于浩
河南省科學院植物保護與環境學院，新鄉453003，中國
摘要
Fusarium graminearum是一種破壞性真菌病原體，會導致玉米、小麥和大麥等谷物作物發生嚴重病害。在玉米中，它是導致莖稈腐爛的主要致病因子，導致產量大幅下降，并產生威脅人類和動物健康的霉菌毒素。本研究提出并評估了一種新型核酸檢測平臺，該平臺結合了重組酶聚合酶擴增（RPA）和CRISPR/Cas12a系統，用于快速識別玉米中的F. graminearum。通過靶向翻譯延伸因子1α（EF-1α）基因，該檢測方法能夠將F. graminearum與具有高度保守性的相關物種區分開來。經過系統優化后，所提出的方法使用側向流動條（LFS）和綠色熒光可視化技術，對F. graminearum的檢測表現出高靈敏度和特異性。該方法能夠在20分鐘內檢測到低至0.63 pg（13個拷貝）的F. graminearum DNA，并且在接種后4天內就能可靠地識別出玉米胚芽鞘和田間樣本中的感染。值得注意的是，這種方法提供了一種快速、靈敏且特異性的F. graminearum可視化、檢測和鑒定方法，無需專門的技術知識或昂貴的儀器設備。通過將CRISPR/Cas12a的特異性與RPA的快速擴增能力相結合，該檢測方法成為玉米生產系統中早期準確檢測病原體的強大工具。
引言
玉米（Zea mays L.）是一種重要的谷物作物，在全球范圍內廣泛種植，用于食品和動物飼料。根據聯合國糧食及農業組織的數據，2023年全球玉米產量約為12.1億噸，其中中國貢獻了2.77億噸，占總產量的約22.8% [1]。玉米的生產力受到多種病害的威脅，其中莖稈腐爛尤為嚴重。這種病害主要由Fusarium屬真菌引起[2]，在中國Fusarium graminearum是主要的致病菌種。最近，有報道稱Bipolaris maydis也是中國河南省莖稈腐爛的另一種致病因子[3]，而在印度Trichoderma屬真菌也成為該病害的新病原體[4]。
Fusarium病原體不僅會降低作物產量，還會產生有害的霉菌毒素，如毒性次級代謝產物脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON），這引發了全球對食品安全的擔憂[5]、[6]、[7]。F. graminearum是導致玉米莖稈和穗部腐爛的主要病原體，也是DON的主要產生者[8]。它進入食物鏈對人類和動物健康構成嚴重風險，因此迫切需要早期和準確的病原體檢測[9]。
傳統的F. graminearum鑒定方法依賴于耗時的培養和形態學分析，這些過程需要專門的技術知識，無法滿足快速檢測的需求。相比之下，分子檢測方法具有更高的特異性、靈敏度和效率[10]。在過去十年中，包括PCR、實時PCR和嵌套PCR在內的核酸擴增方法被廣泛用于病原體檢測[11]、[12]。已經開發了許多針對F. graminearum的PCR和qPCR方法，但這些方法依賴于復雜的熱循環儀，限制了其在田間的應用。環介導等溫擴增（LAMP）是一種適用于現場檢測的可行替代方法[16]、[17]，并且已被開發用于F. graminearum的檢測[18]。盡管LAMP相比傳統方法和實時PCR具有優勢，但它容易發生非特異性擴增，且需要溫度控制設備（65°C）和1小時的擴增時間[19]、[20]。
最近將CRISPR-Cas系統整合到分子診斷技術中，為高特異性核酸檢測開辟了新的途徑[21]。與傳統方法不同，基于CRISPR的檢測方法將擴增與Cas核酸酶（例如Cas12a）的序列特異性識別相結合，當Cas12a與其靶標結合時，會對單鏈DNA報告基因進行切割[22]、[23]。這種機制可以有效區分真實靶標和非特異性擴增產物，從而解決了LAMP等技術的關鍵局限性[24]。重組酶聚合酶擴增（RPA）在低溫下的快速擴增能力與CRISPR/Cas12a的特異性相結合，已被證明是開發適用于田間檢測的各種植物病原體（如Magnaporthe oryzae、F. fujikuroi、F. oxysporum、F. circinatum和F. asiaticum [27]、[28]、[29]、[30]、[31]）的強大工具。
本研究提出并評估了一種新型核酸檢測平臺，該平臺利用RPA和CRISPR/Cas12a系統的協同作用，實現玉米中F. graminearum的快速和特異性鑒定。
真菌菌株來源
F. graminearum分離株來自中國河南省不同地區的受感染玉米莖稈，包括新鄉、鄭州、濮陽、洛陽和南陽市。此外，還從河南省科學院（新鄉）的菌種收藏庫中獲得了其他常見于玉米的真菌的參考菌株，包括F. proliferatum、F. solani、F. oxysporum、F. verticillioides、Bipolaris maydis和Pythium aphanidermatum。
RPA引物和crRNA的設計與優化
根據RPA指南，基于F. graminearum的EF-α基因手動設計了五對RPA擴增引物（表2）。使用多種Fusarium物種的基因組DNA進行特異性測試后發現，引物對RPA-FgF2/R2對F. graminearum具有高特異性，未觀察到在其他物種中的非特異性擴增（圖2A-C）。
設計了兩種crRNA，以PAM基序（5′-TTC-3′）為靶標，引導Cas12a的轉切割。
討論
本研究提出的新型檢測方法包括在39°C下進行10分鐘的RPA介導的EF-1α基因擴增，隨后在37°C下進行10分鐘的CRISPR/Cas12a檢測。結果可以通過綠色熒光（470 nm激發波長）或側向流動條（LFS）讀數進行可視化，為不同的田間條件提供了靈活的檢測選項。側向流動條（LFS）因其速度快、操作簡單、穩定性高和可視化讀數方便而受到廣泛應用。
結論
將重組酶聚合酶擴增（RPA）與CRISPR/Cas12a系統結合的雙重檢測方法在LFS和綠色熒光可視化下證明了對F. graminearum的可靠檢測。RPA-CRISPR/Cas12a檢測方法顯示出高檢測特異性和靈敏度，檢測限為0.63 pg（13個拷貝）的基因組DNA。該方法還具有快速檢測能力，能夠在短時間內完成整個過程。由于其便攜性和簡單性，
CRediT作者貢獻聲明
王艷芬：撰寫——原始草稿、方法學設計、實驗研究。高旭鵬：軟件開發、實驗研究、數據管理。李振康：軟件開發、實驗研究。張宏偉：方法學設計、數據分析。王柳豪：資源準備、實驗研究。張強：驗證、數據分析。孫菲菲：方法學設計。周峰：撰寫——審稿與編輯、項目監督、概念構思。于浩：撰寫——審稿與編輯、項目管理、資金申請。
利益沖突聲明
作者聲明沒有已知的財務利益沖突或個人關系可能影響本文的研究結果。
致謝
作者感謝Chillán大學農學系Ernesto A. Moya-Elizondo教授對本文的進一步修訂。本研究得到了河南省重點研發項目（編號：231111111000、241111311900）、河南省高校重點科研項目（編號：25B210001）以及HIST大學生創新創業培訓項目的支持（編號：10467CXCY2025105）。
