《Biosensors and Bioelectronics》：COF-Confined CsPbBr
3 Nanocomposite with CRISPR/Cas12a-Driven DNA Walking for Ultrasensitive Electrochemiluminescent Detection of Circulating Tumor DNA
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開發了一種基于共價有機框架（COF）限定的CsPbBr3納米材料和CRISPR/Cas12a驅動的DNA walking擴增策略的高靈敏度電化學發光（ECL）生物傳感器。COF通過穩定納米晶體、調節界面電荷轉移和程序化固定DNA探針提升性能，Cas12a激活后逐步切割淬滅鏈恢復ECL信號，無需PCR或等溫擴增。優化條件下檢測限達5.4 fM，對單堿基錯配選擇性好，適用于稀釋血清和臨床血漿樣本，展示了材料-酶協同策略在ctDNA檢測中的潛力。
Jin Nong|Zhiyong Pan|Yucui Li|Jihua Wei|Yuanxun Gong|Jun Li|Kai Zhang|Xianjiu Liao
廣西百色右江民族醫學院附屬醫院重癥醫學科，533000，中國
摘要
本文開發了一種高靈敏度的電化學發光生物傳感器，用于循環腫瘤DNA的檢測。該傳感器結合了共價有機框架和限域的CsPbBr3納米復合材料，并采用了CRISPR/Cas12a驅動的擴增策略。共價有機框架不僅在水環境中穩定了CsPbBr3納米晶體，還調控了界面電荷轉移，并實現了DNA探針的可編程固定。當識別到目標序列時，Cas12a被激活并逐步切割表面連接的淬滅劑修飾的DNA鏈，從而逐步恢復電化學發光。這種表面限域的信號放大方法無需聚合酶鏈反應或等溫預擴增。在優化條件下，該生物傳感器在10 fM至10 nM的濃度范圍內表現出線性響應，檢測限為5.4 fM。該方法對單堿基錯配具有良好的選擇性，并在稀釋的血清和臨床血漿樣本中表現出良好的性能。這些結果突顯了一種材料-酶協同策略在敏感且穩健的核酸檢測中的潛力，為基于電化學發光的循環腫瘤DNA分析提供了一個概念驗證平臺。
引言
循環腫瘤DNA（ctDNA）是在腫瘤發生過程中釋放到血液中的游離DNA（cfDNA）的一部分，是非侵入性癌癥診斷、預后和治療監測的強大生物標志物。（Cai等人，2026年；Guo等人，2022年；Wang等人，2025年）在各種ctDNA生物標志物中，表皮生長因子受體（EGFR）基因的突變在非小細胞肺癌（NSCLC）中具有特別的臨床意義。（Lai等人，2025年）值得注意的是，EGFR外顯子21的L858R點突變是最常見的驅動突變之一，約占所有EGFR突變的40-45%，與外顯子19缺失一起，占EGFR突變NSCLC病例的近90%。（Zhou等人，2023年）L858R突變的存在是預測EGFR酪氨酸激酶抑制劑治療反應的公認生物標志物，當腫瘤組織不可用或不足時，基于ctDNA的EGFR L858R檢測已被廣泛用于臨床液體活檢。（Zhang等人，2024年）從分析角度來看，EGFR L858R是一個單核苷酸變異（SNV），僅與野生型序列相差一個堿基，在大量野生型cfDNA的存在下其檢測難度極高。（Qing等人，2025年；Tan等人，2023年）早期和準確的ctDNA檢測可以實時了解腫瘤負擔和治療反應，補充甚至替代組織活檢。（Pan等人，2025年；Wang等人，2023c）傳統的分析方法如數字PCR（Geng等人，2020年；Pham等人，2022年）、下一代測序（Newman等人，2014年）具有高特異性，但受到高成本、勞動密集型工作流程和較長周轉時間的限制。（Das等人，2016年）此外，它們的靈敏度常常受到ctDNA極低豐度和復雜生物基質中大量野生型核酸的干擾。新興的生物傳感策略，包括電化學發光（ECL）（Qi等人，2024年；Qing等人，2025年）、熒光（Tan等人，2023年；Yang等人，2024年）、表面增強拉曼光譜（Zhou等人，2016年）和電化學測定（Shi等人，2025年）提高了靈敏度，但許多方法仍需要復雜的樣品預處理，或者無法同時實現高靈敏度和操作簡便性。在這些方法中，ECL傳感因其低背景信號、寬動態范圍和出色的可控性而脫穎而出，即使在復雜的生物環境中也能實現超靈敏檢測。（Meng等人，2024年；Yao等人，2021年）因此，開發新型ECL生物傳感平臺對于實現快速、準確和高度選擇性的ctDNA分析具有巨大潛力。
鹵化鉛鈣鈦礦納米晶體（NCs）是一類具有通用化學式ABX3（A = Cs+，B = Pb2+，X = Cl-/Br-/I-）的半導體納米晶體。（Li等人，2024c；Wang等人，2023a）其中，銫鉛溴化物（CsPbBr3）NCs表現出優異的光致發光量子產率、窄發射帶寬和可調帶隙，使其成為非常有吸引力的ECL發射體。（Pu等人，2020年）盡管具有這些優勢，CsPbBr3的離子晶格和不穩定的表面配體導致其在水環境中快速降解和相變，嚴重限制了其在生物傳感中的應用。（Sun等人，2024年）已經探索了多種封裝策略——如二氧化硅殼（Li等人，2019年）、聚合物基質（Fu等人，2025年）和金屬-有機框架（Lai等人，2024年；Rambabu等人，2020年）來提高水穩定性（Li等人，2020年），但每種方法都有缺點，如電荷傳輸差、孔隙率有限或合成繁瑣（Li等人，2024a）
共價有機框架（COF）是一類通過強共價鍵連接的結晶多孔聚合物，具有高表面積、有序的中孔通道和出色的化學穩定性。（Zhang等人，2025b；Zhang等人，2018年）它們可調的孔徑和疏水微環境允許客體納米晶體在明確定義的腔體內成核和生長。（Niu等人，2025年；Zhang等人，2025a）通過將CsPbBr3 NCs限制在COF孔內，鈣鈦礦NCs在空間上受到限制并受到保護，有效抑制聚集，保持光學性質，并顯著提高水介質中的ECL性能（Leng等人，2023年；Li等人，2024a）。除了提高水穩定性外，COF還在改善ECL生物傳感器性能方面發揮著不可或缺的作用。有序的π共軛框架促進了界面電荷轉移，從而提高了ECL效率。同時，內在的孔隙率和納米通道使得鈣鈦礦NCs和DNA組裝在空間上受到限制，抑制聚集并增加電極界面處的局部反應物濃度。此外，化學可尋址的COF框架允許DNA支架的可編程固定，確保探針定向和控制CRISPR/Cas12a的激活。由于結構限制和電子調控的協同效應，COF作為主動的界面調節劑而非被動的穩定劑，為高性能ECL生物傳感提供了堅實的基礎。
規律間隔短回文重復序列（CRISPR）系統是細菌和古菌中的適應性免疫機制，利用CRISPR相關（Cas）核酸酶識別和切割外來核酸。（Wang等人，2023b）CRISPR家族包括多種酶，如Cas9（Moitra等人，2024年）用于位點特異性雙鏈DNA切割，Cas13（Wei等人，2025年；Zhou等人，2020a）用于RNA靶向，以及Cas12（Li等人，2024b；Lu等人，2025）亞型用于具有附帶切割活性的DNA識別。其中，Cas12a因其可編程的crRNA引導、高序列特異性和顯著的“跨切割”能力而在生物傳感應用中脫穎而出：一旦被互補目標激活，Cas12a會非特異性切割周圍的單鏈DNA報告分子，從而實現強大的信號放大（Ge等人，2021年；Wang等人，2026年）。這一特性已被廣泛用于構建超靈敏的核酸生物標志物檢測方法，包括ctDNA、微RNA和傳染性病原體，通常與等溫擴增或基于納米材料的ECL平臺結合使用。將Cas12a整合到ECL傳感器中，從而提供了極高的特異性和酶驅動的信號增益，使其成為本研究中開發的傳感策略的關鍵組成部分。
DNA行走是指一類動態擴增策略，其中分子識別事件轉化為沿DNA軌道或底物的逐步連續反應，從而實現信號積累，超越單一結合或切割事件。（Chen等人，2019年；Zhou等人，2020b）與傳統的一步擴增相比，DNA行走提供了更高的靈敏度、固有的信號積累和更好的穩健性，通過將局部分子相互作用轉化為漸進的輸出。（Yan等人，2018年）迄今為止，已經報道了幾種DNA行走機制，包括依賴于編程DNA軌道設計的鏈位移驅動行走器（Wang等人，2020年）、涉及外切酶或切割酶的酶輔助行走器（Yao等人，2019年），以及基于CRISPR附帶切割的擴增系統（Yuan等人，2024年）。雖然鏈位移和多酶策略通常需要復雜的序列工程或嚴格的反應條件，但CRISPR驅動的DNA行走利用酶的切割活性作為內在驅動力。當Cas12a在電極界面受限時，其跨切割驅動的DNA行走將隨機的附帶切割轉化為局部和準過程性反應。與傳統的擴增策略（如CHA或鏈位移）不同，這些策略涉及獨立的催化循環，這種機制將單一激活事件轉化為沿多個表面連接底物的漸進切割。（Yang等人，2026年）界面限域的設計消除了對復雜DNA軌道的需求，直接將逐步的DNA去除與連續的ECL信號恢復耦合，使其特別適用于超靈敏的界面生物傳感。
基于上述優勢，我們報告了一個合理整合的ECL生物傳感器平臺，該平臺利用了COF限域的CsPbBr3界面和CRISPR/Cas12a的雙模活動的協同作用。在這個工程化的界面中，COF框架將鐵茂（Fc）-DNA底物組織成表面限域的支架，而Cas12a通過crRNA引導的目標識別提供等位基因特異性激活。激活后，Cas12a的跨切割活性驅動沿空間組織的支架進行逐步的DNA行走過程，將分子識別轉化為漸進的ECL信號恢復。通過將鈣鈦礦穩定、界面信號調控和CRISPR介導的特異性-擴增整合到一個連貫的系統中，這一策略克服了現有基于鈣鈦礦或CRISPR的ECL傳感器的關鍵限制，實現了超靈敏和穩健的ctDNA檢測。
實驗部分
ECL生物傳感器檢測ctDNA的原理
如圖1所示，所提出的生物傳感器結合了COF限域的CsPbBr3 ECL發射體和CRISPR/Cas12a驅動的DNA行走擴增策略，用于超靈敏的ctDNA檢測。CsPbBr3 NCs在COF的有序中孔內原位生長，其中剛性且疏水的框架提高了水穩定性，抑制了聚集，并改善了界面電荷轉移，形成了一個穩健的ECL界面。Fc-DNA鏈固定在COF/CsPbBr3表面上，
結論
總之，開發了一種基于COF/CsPbBr3的ECL生物傳感器，結合了CRISPR/Cas12a驅動的DNA行走擴增，用于超靈敏的ctDNA檢測。COF框架作為主動的界面調節劑，而不僅僅是穩定的基質，同時提高了鈣鈦礦的水穩定性，促進了電荷轉移，并在限域的電極界面內組織了DNA探針。
CRediT作者貢獻聲明
Kai Zhang：寫作——審稿與編輯，概念構思。Xianjiu Liao：項目管理，概念構思。Zhiyong Pan：形式分析，數據管理。Jin Nong：寫作——初稿，方法學，研究。Jihua Wei：驗證，方法學。Yucui Li：軟件，方法學，研究。Jun Li：寫作——審稿與編輯，項目管理，資金獲取，概念構思。Yuanxun Gong：監督，項目管理
利益沖突聲明
作者聲明他們沒有已知的競爭性財務利益或個人關系可能會影響本文報告的工作。
致謝
本工作得到了國家自然科學基金（82360259）、廣西自然科學基金（2025GXNSFHA069115）、生命科學分析化學國家重點實驗室（SKLACLS2314）、廣西骨與關節退行性疾病基礎與轉化研究重點實驗室（21-220-06-202205）以及百色生物醫學分析化學與臨床分子診斷重點實驗室的財政支持。
