《Journal of Agricultural and Food Chemistry》：Self-Assembling Nanoparticle Enhances RNA Interference Efficiency against Hyphantria Cunea (Drury) with Minimal Risk to Nontarget Organisms
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本文推薦了一種基于噬菌體MS2病毒樣顆粒（VLP）的高效、安全的RNAi害蟲防治新策略。作者通過在大腸桿菌中表達并自組裝展示HIV TAT肽的MS2-VLPs，成功封裝并遞送針對美國白蛾（Hyphantria cunea）關鍵基因的hpRNA，顯著提升了hpRNA的核酸酶抗性和環境穩定性，并增強了其在害蟲中腸細胞的內化效率。實驗證明，該系統能以較低劑量實現強效的基因沉默和害蟲控制，且對三種非靶標生物無不良影響，為開發可規模化生產、環境友好的RNA生物農藥提供了有力技術支撐。
1. 引言
美國白蛾（Hyphantria cunea）是一種原產北美、現已入侵亞歐多國的檢疫性農林害蟲，其取食量大、寄主廣、繁殖力強，造成嚴重經濟損失。目前主要依賴廣譜化學農藥進行防治，導致“3R”（抗性、再猖獗、殘留）問題日益突出。開發兼具殺蟲活性和生態安全性的新型生物農藥勢在必行。RNA干擾（RNAi）技術通過遞送靶向害蟲關鍵基因的雙鏈RNA（dsRNA）來特異性抑制基因表達，是一種極具潛力的害蟲綠色防控手段。然而，鱗翅目昆蟲普遍存在dsRNA不穩定、細胞攝取效率低、RNAi機制不敏感等瓶頸。病毒樣顆粒（VLPs）作為無感染性的納米顆粒，可模擬病毒結構，有效包封和保護核酸分子。其中，源自RNA噬菌體的MS2-VLPs由180個衣殼蛋白自組裝形成直徑22-29納米的二十面體結構，已被用于遞送RNA、多肽和藥物。在衣殼表面展示HIV的TAT（Trans-Activator of Transcription）細胞穿透肽（CPP）能顯著提升其穿越細胞膜的能力。本研究構建了一種在大腸桿菌中自組裝、并展示TAT肽的MS2-VLPs平臺，用于遞送靶向美國白蛾關鍵基因的發夾RNA（hpRNA），旨在提高RNAi效率，并評估其對非靶標生物的安全性。
2. 材料與方法
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2.1 昆蟲飼養：美國白蛾卵塊采自江蘇徐州，幼蟲在26±1°C、相對濕度65±5%、光暗周期14:10小時的人工氣候室中，以人工飼料和楊樹葉飼喂至三齡。
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2.2 靶基因選擇與序列鑒定：基于在棉鈴蟲和美國白蛾中的已知有效性，選擇了四個潛在RNAi靶標基因：NDUFVII、ACE、V-ATPase A和V-ATPase D。同時，為研究dsRNA內吞途徑，也關注了Clathrin、Eater和SIL基因。通過本地BLAST比對從NCBI數據庫獲取的注釋序列。
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2.3 體外dsRNA合成與注射：利用siDirect在線工具預測高效siRNA，設計特異性引物并通過T7 RNA聚合酶系統合成dsRNA。將4 μg dsRNA顯微注射入四齡幼蟲腹部，評估死亡率和靶基因沉默效果。
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2.4 通過“RNAi of RNAi”分析dsRNA內化機制：通過共注射dsATPaseA與靶向內吞相關基因（Clathrin、Eater、SIL）的dsRNA，評估這些基因沉默對RNAi效率的影響，以解析美國白蛾攝取dsRNA的主要途徑。
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2.5 hpRNA與MS2-VLPs在大腸桿菌中的表達：使用攜帶兩個T7啟動子表達盒的單一質粒系統，一個表達靶向V-ATPase A或D的hpRNA（含GA20內含子形成發夾結構及pac包裝位點），另一個表達與TAT肽融合的MS2衣殼蛋白二聚體（MS2）。在缺乏RNase III的HT115(DE3)大腸桿菌中經IPTG誘導共表達，實現hpRNA在MS2-VLPs內的封裝。
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2.6 MS2-VLPs的純化與透射電鏡觀察：通過蔗糖梯度超速離心純化VLPs，使用透射電鏡觀察其形態和大小分布。
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2.7 MS2-VLPs內封裝hpRNA的分析：純化VLPs后，用蛋白酶K消化衣殼蛋白，提取內部hpRNA，通過天然瓊脂糖凝膠電泳驗證封裝成功。
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2.8 純化hpRNA與MS2封裝hpRNA對美國白蛾幼蟲的顯微注射：向三齡幼蟲注射純化的hpRNA或MS2封裝的hpRNA，監測存活率、體重變化及靶基因表達量。
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2.9 MS2封裝hpRNA的穩定性分析：將表達hpRNA或MS2-hpRNA的細菌裂解液與美國白蛾中腸液和血淋巴混合孵育，或噴灑于楊樹葉表面，通過電泳和絕對定量RT-qPCR評估hpRNA的降解情況，檢驗MS2-VLPs的保護作用。
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2.10 相對與絕對轉錄本定量：使用RT-qPCR分析靶基因的相對表達水平。通過絕對定量RT-qPCR檢測大腸桿菌中hpRNA積累量、葉片表面殘留量及昆蟲攝入量。
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2.11 人工飼料飼喂生物測定：將不同濃度（1×1010、5×109、2.5×109cfu/mL）的工程菌（表達hpGFP、MS2、hpATPaseA、MS2-hpATPaseA）摻入人工飼料，連續飼喂三齡幼蟲，記錄存活率、體重、化蛹率及靶基因表達。
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2.12 基于基因序列的脫靶效應計算機預測：針對三種非靶標生物——楊扇舟蛾（Clostera restitura，鱗翅目）、楊梢葉甲（Plagiodera versicolora，鞘翅目）和白蛾周氏嚙小蜂（Chouioia cunea，膜翅目），將靶向美國白蛾V-ATPase A的hpRNA虛擬切割成377條21-nt siRNA，使用BLASTn-short比對其CDS序列，篩選具有17-21 nt匹配（最多允許2個錯配/1個間隙）的潛在脫靶位點。
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2.13 MS2-hpATPaseA對非靶標生物（NTOs）的體內風險評估：用高濃度工程菌（表達hpGFP、MS2、hpATPaseA、MS2-hpATPaseA）處理楊樹葉飼喂兩種植食性非靶標昆蟲，或用含菌蔗糖溶液飼喂寄生蜂，評估其存活率、體重、取食面積及潛在靶基因表達量，美國白蛾作為陽性對照。
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2.14 統計分析：使用SPSS軟件進行數據分析。基因表達數據采用t檢驗或單因素方差分析（ANOVA）及相應的事后檢驗。生存曲線采用Kaplan-Meier法分析，組間差異使用log-rank檢驗。
3. 結果
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3.1 美國白蛾RNAi靶基因篩選及dsRNA內化途徑鑒定：顯微注射dsRNA實驗表明，沉默V-ATPase A、V-ATPase D和NDUFVII能顯著降低幼蟲存活率，而沉默ACE影響不顯著。因此選擇V-ATPase A和D進行后續研究。通過“RNAi of RNAi”實驗發現，沉默Clathrin基因會完全消除dsATPaseA引發的基因沉默效應，而沉默Eater或SIL則無顯著影響，表明網格蛋白介導的內吞作用是美國白蛾攝取dsRNA的關鍵途徑。
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3.2 hpRNA在MS2-VLPs中的封裝：天然凝膠電泳證實了大腸桿菌成功表達了hpGFP、hpATPaseA和hpATPaseD。SDS-PAGE和Western blot驗證了TAT融合的MS2衣殼蛋白表達。透射電鏡觀察顯示，表達MS2、MS2-hpATPaseA和MS2-hpATPaseD的細菌純化后存在均勻的二十面體病毒樣顆粒，而僅表達hpRNA的細菌樣品中未見此類結構。顆粒大小分析顯示，展示TAT肽的MS2顆粒（約30 nm）大于未展示的2CP顆粒（約24-26 nm）。從純化的VLPs中提取的RNA經熱變性處理后，電泳檢測到了相應的hpRNA條帶，證實了hpRNA被成功封裝在MS2衣殼內部。
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3.3 MS2封裝增強hpRNA穩定性：將細菌裂解液與美國白蛾體液孵育后，裸露的hpRNA迅速降解，而MS2封裝的hpRNA保持完整。將工程菌噴灑到楊樹葉表面后，裸露的hpATPaseA在48小時后即檢測不到，而MS2封裝的hpATPaseA在72小時后仍有殘留。絕對定量PCR結果進一步量化了這一保護效果。
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3.4 MS2-hpATPaseA對美國白蛾的防治效率：顯微注射實驗中，注射MS2-hpATPaseA和純化hpATPaseA均導致約75-80%的高死亡率，并顯著抑制靶基因表達和幼蟲增重。在飼喂實驗中，與飼喂裸露hpATPaseA的細菌相比，飼喂MS2-hpATPaseA工程菌在各個濃度下均導致更高的幼蟲死亡率、更顯著的靶基因表達抑制以及更嚴重的生長阻滯。絕對定量PCR顯示，MS2封裝提升了害蟲對hpRNA的攝入量。
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3.5 hpATPaseA的脫靶預測：計算機預測分析顯示，針對三種非靶標生物，hpATPaseA產生的siRNA序列與它們的V-ATPase A基因雖有部分匹配，但完全匹配的21-nt連續序列極少（僅在楊扇舟蛾中發現1條），大部分匹配長度較短（17-19 nt）且存在錯配。
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3.6 MS2-hpATPaseA對非靶標生物的風險評估：體內實驗表明，用高濃度工程菌處理對美國白蛾（陽性對照）造成了高死亡率、靶基因抑制、體重下降和取食減少。然而，相同的處理對三種非靶標生物（楊扇舟蛾、楊梢葉甲、白蛾周氏嚙小蜂）的存活率、潛在靶基因表達、體重和取食面積均未產生顯著負面影響。
4. 討論
本研究證明，基于MS2-VLPs的自組裝納米遞送系統能有效封裝hpRNA，顯著提高其對抗美國白蛾中腸核酸酶和環境降解的穩定性。表面展示的TAT肽進一步增強了hpRNA的細胞攝取效率。該生物源納米載體系統在較低劑量下即可實現高效的害蟲控制，且生產成本具有優勢。盡管計算機預測顯示與部分非靶標生物的基因存在有限序列相似性，但體內風險評估證實其對三種代表性的非靶標生物安全。該研究為開發規模化、高效且環境友好的RNAi生物農藥提供了一個有前景的技術平臺。未來研究需優化微生物細胞工廠、開發無抗性標記表達系統，并在田間條件下進一步驗證其持久性和實際防效。
