牛奶脂肪百分比是評估牛奶品質的關鍵指標之一。作為牛奶中主要的營養成分，牛奶脂肪為人類提供了優質的天然脂肪來源。高脂肪含量的牛奶口感更佳，風味更濃郁，同時也是奶油、煉乳、奶酪和黃油等加工食品的重要原料。牛奶脂肪百分比這一性狀具有高度遺傳性，其合成是一個動態且復雜的多網絡調控過程，涉及大量基因的參與。常見的荷斯坦奶牛乳脂率通常在3.6%到4.0%之間。奶牛的脂肪代謝與合成涉及許多關鍵組分，包括負責從頭脂肪酸合成的基因如FASN、ACACA和SCD，以及參與脂肪酸攝取、轉運和活化的LPL與VLDLR等。此外，如mTOR、SREBP、PPARG和AMPK等信號通路和轉錄因子對乳脂代謝與合成的調控也至關重要。在乳脂代謝中，已有研究報道微小RNA可通過調控脂肪酸的合成、轉運和氧化來影響奶牛乳腺上皮細胞內的脂質含量。例如，miR-29b靶向LPL和TDG，miR-2382-5p靶向NDRG2以促進BMECs中的脂質合成，而miR-423-5p則靶向FAM3A影響肝臟糖脂代謝，miR-125b靶向ACC和FASN通過脂肪酸合成途徑促進肝臟脂質積累。

外泌體是納米尺度的細胞外囊泡（30–150 nm），現被認為是細胞間通訊的關鍵參與者。它們源自多泡體與質膜的融合，由包括干細胞、免疫細胞和癌細胞在內的多種細胞分泌。外泌體內富含多樣化的蛋白質、脂質和核酸貨物。其中的mRNA、miRNA、circRNA和lncRNA具有顯著的多樣性，并在多種生物過程中發揮著關鍵作用。近期的研究表明，外泌體參與細胞間通訊、免疫反應、組織修復與再生以及脂質代謝等過程。外泌體還可以作為生物載體直接運輸脂質，包括脂肪酸、類二十烷酸和膽固醇。牛奶是這些囊泡的豐富來源，其攜帶包括蛋白質、脂質和核酸在內的多種遺傳物質，在營養輸送和免疫調節中扮演重要角色。牛奶來源的外泌體miRNA有助于細胞間通訊并調節腸道微生物群，從而在脂質代謝和免疫反應等關鍵生物過程中發揮調控作用。例如，水牛乳外泌體通過減少脂質沉積和改善血清脂質譜，從而緩解高脂飲食誘導的小鼠肝臟脂質紊亂。牛奶來源的外泌體miR-148a和其他生物活性成分通過促進脂肪細胞增殖和分化，積極參與全身脂質代謝的調節。外泌體miR-11987則促進白色脂肪細胞的棕色化并增強線粒體能量代謝，從而減少體重增加，為肥胖提供了潛在的治療策略。這些外泌體分子還有助于表觀遺傳調控和神經免疫調節，凸顯了其多方面的生物學作用。

盡管越來越多的證據表明外泌體miRNA可以調節脂質代謝，但來自不同乳脂含量奶牛牛奶的外泌體，其miRNA組成和功能是否存在差異，目前仍不清楚。本研究旨在利用體外BMEC模型，對高、低乳脂含量奶牛牛奶來源外泌體中的miRNA進行表達譜分析和功能表征，從而為闡明其在牛奶脂肪合成中的作用提供機制性見解。

DHI數據收集

本研究采集了從2021年1月到2023年2月期間共計17,838條荷斯坦奶牛的DHI數據。根據泌乳階段（早期：0–99天；中期：100–199天；后期：200–299天；末期：≥300天）進行了比較分析、方差分析（ANOVA）和相關性分析。基于這些分析，選擇處于泌乳后期且分娩次數兩次或以上的奶牛作為候選對象。高乳脂組的乳脂百分比高于4.5%，低乳脂組的則低于3%。

差速超速離心法分離牛奶來源外泌體

首先通過離心去除乳脂肪和脫落的乳腺上皮細胞。隨后進行一系列梯度超速離心步驟（30,000 × g60分鐘、50,000 × g60分鐘、70,000 × g60分鐘），并經過0.45 μm和0.22 μm過濾，最后在120,000 × g下離心90分鐘收集外泌體沉淀。

納米顆粒追蹤分析與電鏡實驗

使用納米顆粒追蹤分析儀測定外泌體粒徑分布。通過透射電鏡觀察外泌體形態，可見典型的雙層膜結構的球形囊泡。

miRNA測序分析與驗證

從牛奶來源外泌體中提取總RNA。小RNA測序文庫由LC-Bio公司構建，并在Illumina HiSeq 2000/2500平臺上進行測序。數據分析流程包括：去除接頭及低質量序列、長度篩選（18–26 nt）、比對至各RNA數據庫進行過濾、miRNA鑒定、差異表達分析以及靶基因預測與富集分析。差異表達的miRNA通過qRT-PCR進行驗證。

外泌體攝取實驗

使用PKH67試劑盒對分離的外泌體進行熒光標記，然后與BMECs共培養。通過熒光顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡觀察BMECs對標記外泌體的攝取情況。

載體構建

化學合成miR-423-5p和miR-125b的模擬物與抑制物。分別構建靶基因APOA5和SLC27A1的過表達載體以及相應的shRNA慢病毒敲低載體。

細胞培養與轉染

使用Lipofectamine 3000將miRNA模擬物、抑制物或表達載體轉染至BMECs中。

RNA提取與實時定量PCR

使用專門試劑盒提取總RNA并進行反轉錄。使用SYBR qPCR Master Mix進行實時定量PCR檢測，以β-actin作為內參基因。

細胞內脂質成分檢測

使用甘油三酯含量測定試劑盒和總膽固醇測定試劑盒等檢測BMECs內的甘油三酯（TG）、總膽固醇（CHOL）及游離脂肪酸含量。

油紅O與BODIPY染色

通過油紅O染色和熒光染料BODIPY染色，觀察BMECs內脂滴的積累情況。

EdU染色與CCK-8細胞活性檢測

通過EdU細胞增殖檢測試劑盒評估細胞增殖能力，使用CCK-8試劑測定細胞活性。

線粒體膜電位監測

使用JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒評估細胞線粒體膜電位變化。

雙熒光素酶報告基因實驗

構建包含預測結合位點的野生型及突變型APOA5和SLC27A13'-UTR區的熒光素酶報告載體，與miRNA模擬物共轉染BMECs，檢測熒光素酶活性以驗證靶向關系。

Western blot

提取外泌體及細胞總蛋白，檢測外泌體標志蛋白CD9、CD81和TSG101的表達。

統計分析

使用GraphPad Prism 6軟件進行統計分析，數據以平均值±標準誤表示，采用單因素方差分析（ANOVA）配合Dunnett多重比較檢驗或Student's t檢驗，以^*P< 0.05，^**P< 0.01和^***P< 0.001為差異具有統計學意義。

DHI分析及高低MFP分組

對17,838條DHI記錄的分析顯示，泌乳產奶量隨泌乳階段推進而逐步下降。相反，牛奶脂肪百分比（MFP）、牛奶蛋白百分比（MPP）以及乳脂蛋白比則穩步上升。在泌乳后期，MFP達到4.24% ± 1.07%的顯著較高水平。體細胞計數在泌乳后期增加了56.6%，且與乳脂率呈正相關。基于此，選擇泌乳后期（200–299天）、體細胞計數<10⁴cells/mL的二次分娩奶牛作為高、低乳脂百分比（HMF和LMF）分組的候選樣本。

牛奶來源外泌體的分離與鑒定

通過優化后的差速離心法，從HMF和LMF組牛奶中成功分離得到兩組牛奶來源外泌體（分別命名為HMF_EXO和LMF_EXO）。透射電鏡顯示其為典型的雙層膜球形囊泡，粒徑約100 nm。納米顆粒追蹤分析顯示顆粒直徑峰值在100–150 nm之間。Western blot證實所獲囊泡表達外泌體標志蛋白CD9、CD81和TSG101。

與MFP相關的候選miRNA鑒定與篩選

對HMF_EXO和LMF_EXO兩組進行miRNA測序，共鑒定出1,320個差異表達的miRNA，其中496個上調，824個下調。基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析顯示，差異miRNA的靶基因顯著富集于代謝途徑、PPAR信號通路等與脂質代謝相關的通路。qRT-PCR驗證了21個miRNA的表達趨勢與測序結果一致。

外泌體攝取與候選miRNA篩選

熒光標記的外泌體能夠被BMECs有效內吞。用HMF_EXO和LMF_EXO處理BMECs后，qRT-PCR檢測顯示，miR-423-5p在HMF_EXO處理組中表達顯著上調，而miR-125b在LMF_EXO處理組中表達最高。初步功能驗證表明，miR-423-5p和miR-125b對脂質代謝有顯著影響，因此被選為后續研究的候選miRNA。

牛奶來源外泌體miR-423-5p/APOA5增強BMECs脂質代謝

轉染miR-423-5p模擬物可顯著促進BMECs內甘油三酯（TG）和甘油的積累，同時降低總膽固醇（CHOL）含量。油紅O和BODIPY染色顯示，miR-423-5p過表達導致細胞內脂滴顯著增多，而其抑制物則減少脂滴形成。EdU和CCK-8實驗表明，miR-423-5p過表達抑制了BMECs的增殖和活性。線粒體膜電位檢測發現，miR-423-5p過表達降低了線粒體膜電位。qRT-PCR分析顯示，miR-423-5p過表達上調了脂肪生成基因（FASN, SREBP1）和甘油三酯合成相關基因（DGAT1, GPAM）的表達，同時下調了脂肪酸氧化標志物CPT1B的表達。雙熒光素酶報告實驗和表達驗證表明，APOA5是miR-423-5p的功能性靶基因。進一步研究發現，過表達APOA5降低了BMECs內的TG含量并減少了脂滴積累，同時下調了脂肪生成基因（如FASN, SCD）的表達，而上調了脂肪酸氧化基因（如CPT1B）的表達，并抑制了細胞增殖。這些結果表明，外泌體miR-423-5p通過靶向抑制APOA5，促進了BMECs的脂質合成與積累。

牛奶來源外泌體miR-125b/SLC27A1抑制BMECs脂質代謝

轉染miR-125b模擬物增加了BMECs內TG和甘油的含量，同時降低了CHOL含量。用LMF_EXO處理BMECs可重現miR-125b模擬物引起的TG升高趨勢，而用miR-125b抑制物預處理外泌體則消除了這種效應。油紅O和BODIPY染色證實，miR-125b過表達促進了脂滴沉積，而其抑制物則抑制了脂滴形成。功能實驗顯示，miR-125b過表達促進了BMECs的增殖和活性，并降低了線粒體膜電位。基因表達分析發現，miR-125b過表達顯著下調了脂解相關基因（HSL和ATGL）和轉錄調節因子PPARG的表達。雙熒光素酶報告實驗驗證了SLC27A1是miR-125b的直接靶基因。對靶基因SLC27A1的功能研究表明，其過表達降低了BMECs內的TG含量并減少了脂滴積累，同時抑制了細胞增殖，并上調了脂肪生成基因（如FASN, SCD）的表達，下調了β-氧化基因（如CPT1B）的表達。這些結果揭示，外泌體miR-125b通過靶向抑制SLC27A1，對BMECs的脂質合成和分解代謝產生拮抗作用。

乳腺不僅是一個分泌器官，也是一個高度復雜的調控系統。在乳汁合成過程中，BMECs、脂肪細胞和免疫細胞等主動分泌外泌體，這些納米囊泡作為分子信使，攜帶包括miRNA在內的多種遺傳物質，作為反饋信號，精確調控鄰近或自身乳腺上皮細胞的功能活動，優化高能耗的脂質代謝途徑。本研究通過將牛奶來源外泌體重新引入培養的BMECs進行體內外驗證，發現外泌體處理顯著改變了脂質代謝相關基因的表達并增強了脂滴形成，有力地支持了乳腺內存在自調控機制的觀點。選擇二次分娩的奶牛作為研究對象，旨在最大限度地減少非遺傳因素的干擾，從而使觀察到的乳脂百分比差異更有可能歸因于本研究所探討的遺傳和分子機制。

高產奶牛選育的主要目標不僅是提高產奶量，也是生產具有更高經濟價值和更優營養品質的牛奶。其中，乳脂百分比和乳蛋白百分比作為關鍵的泌乳性狀，其重要性不亞于總產奶量。本研究對DHI數據的分析揭示了乳脂含量與泌乳階段之間存在顯著的正相關關系，這與以往關于泌乳中期脂質代謝的研究結果一致。值得注意的是，在泌乳后期，體細胞計數（SCC）增加了56.6%，且與乳脂百分比的升高相關（相關系數r= 0.71）。這一結果表明，乳脂合成可能通過改變參與免疫反應的酶活性來調節乳腺炎癥。盡管乳脂率在泌乳末期達到峰值，但為了盡量減少炎癥的混雜影響，本研究特意選擇了泌乳后期（200–299天）的奶牛作為實驗對象，從而為研究乳脂變異的遺傳決定因素建立了穩定的樣本集。

牛奶中的蛋白質和脂質含量遠高于細胞培養基。為了避免大量蛋白質對外泌體純度的干擾，本研究建立了一套優化方案，結合差速離心和0.22 μm過濾，以獲得粒徑合適的高純度外泌體。PKH67標記的外泌體主要定位于BMECs的細胞質和細胞膜，這與先前關于細胞來源外泌體攝取的研究一致，表明牛奶來源的外泌體通過內吞途徑被細胞攝取。外泌體的脂質保護作用可能解釋了未來研究中觀察到的miRNA的高效遞送。此外，牛奶來源的外泌體具有高效、便捷地操縱外泌體miRNA的潛力，能夠成功地將外泌體miRNA分子遞送至受體細胞。外泌體內容物可以與細胞質中的靶分子相互作用。這是外泌體介導細胞間通訊并調控關鍵細胞過程的一種潛在機制。

外泌體miRNA測序鑒定出1,320個差異表達的miRNA，其中miR-423-5p和miR-125b分別在高、低乳脂組中特異性富集。KEGG富集分析顯示，這些miRNA的靶基因顯著富集于PPAR信號通路和脂肪酸延伸通路。miRNA測序分析表明，高乳脂牛奶外泌體中miR-423-5p的表達顯著升高。HMF_EXO被BMECs攝取后，能產生與外源合成的miR-423-5p模擬物類似的促進TG含量的效應。這表明高乳脂組牛奶來源的外泌體富含可影響脂質代謝的miRNA，并可作為脂質代謝的生物標志物。同時，本研究也探討了miR-125b對TG含量的抑制作用。添加LMF_EXO后，BMECs內的TG含量呈現下降趨勢。進一步實驗表明，將miR-125b抑制物與LMF_EXO預孵育后再添加到BMECs中，產生了“挽救”效應。將本研究在牛奶外泌體中發現的差異miRNA與既往從高、低乳脂率BMECs中提取RNA進行RNA-seq和miRNA-seq聯合分析所發現的差異miRNA進行比較，發現了168個重疊的差異miRNA。值得注意的是，本研究確定的兩個關鍵候選miRNA——miR-423-5p和miR-125b，均包含在此重疊集合中。此外，通過聯合篩選發現的常見差異miRNA，如miR-30c、miR-200和miR-34，已被充分證明在脂質代謝中發揮調控作用。在BMECs與牛奶來源外泌體中觀察到的截然不同的miRNA表達譜表明，外泌體中的miRNA并非全部源自BMECs，BMECs可能有選擇地將特定miRNA包裝進外泌體，以調節乳腺組織內的其他細胞類型。這些比較結果支持了我們的假設：即具有不同乳脂表型的奶牛會產生攜帶不同miRNA貨物的外泌體，進而差異性地調節乳腺細胞的代謝活性。

乳腺中的各種細胞類型通過外泌體的分泌與傳遞，調節BMECs的乳脂合成并影響乳腺健康。本研究系統地闡明了牛奶來源的外泌體miR-423-5p和miR-125b通過APOA5/SLC27A1-SREBP1/PPARγ網絡調控脂質代謝的分子機制。在BMECs中的驗證結果顯示，APOA5的過表達顯著抑制了SREBP1和PPARγ的表達，這與SREBP1-PPARγ軸在調節脂質代謝中的核心作用一致。然而，本研究進一步闡明，APOA5通過上調CPT1B的表達來促進脂肪酸氧化。相反，干擾SLC27A1則增加了PPARγ的表達，從而通過激活GPAM和DGAT1來促進TG合成，這與AGPAT6的作用途徑相似，但強調了脂肪酸攝取階段的重要性。升高的線粒體膜電位與增強的線粒體生物能量活性相關，而其下降則反映了去極化和功能損傷。這種擾動會損害ATP合成效率并破壞TG生物合成途徑，特別是催化脂肪酸與甘油酯化的二酰基甘油酰基轉移酶（DGAT）。綜上所述，這些發現描繪了外泌體在BMECs中通過一個錯綜復雜的調控網絡，其中miRNA靶向APOA5基因和SLC27A1對脂質代謝產生相反的影響，而這一過程從根本上受到線粒體生物能量狀態的制約。本研究為理解細胞內脂質穩態提供了一個新的機制框架。本研究的局限在于僅在一個體外模型中驗證了外泌體對BMECs的影響以及特定miRNA的作用機制，因此其對脂肪細胞等其他乳腺細胞類型的影響仍有待進一步研究。

本研究假設，高、低乳脂率奶牛乳汁中的外泌體在分子譜上存在顯著差異。具體而言，優質高產奶牛可能產生功能上獨特、質量更高的信使，這些信使積極促成優異的乳性狀。這些結果為參與乳脂合成與調控的關鍵功能載體和調節因子提供了新的見解。這不僅加深了我們對乳脂合成調控的理論理解，也為基于外泌體miRNA標志物的乳品質早期預測以及通過調控miRNA表達實現乳成分的定向改良奠定了基礎。將外泌體作為功能生物標志物納入基因型輔助選擇策略，可以顯著提高育種決策的準確性和效率。利用幼齡犢牛血液樣本中的這些miRNA來預測未來乳品質是一個誘人的可能性。然而，在考慮任何育種應用之前，這種方法需要進一步的驗證，以確認這些miRNA在循環中的存在及其預測能力。

本研究證實，牛奶來源的外泌體miRNA通過miR-423-5p/APOA5軸和miR-125b/SLC27A1軸，成為調控牛奶脂肪合成的關鍵調節因子。這些發現為理解牛奶脂肪組成的分子決定因素提供了關鍵見解，并揭示了細胞間通訊在乳腺中的核心作用。