雞傳染性支氣管炎病毒（IBV），作為冠狀病毒科（Coronaviridae）Gammacoronavirus屬的代表成員，是全球養禽業最重要的病原體之一。該病毒通過呼吸道在家禽群中快速傳播，導致高發病率以及因生長遲緩、產蛋量下降和繼發感染造成的巨大經濟損失。IBV具有廣泛的組織嗜性，主要靶向呼吸道，但也影響腎臟、生殖系統和胃腸道，從而導致復雜多樣的病理結果。自1931年被首次描述以來，全球已報道了多種血清型和基因型，如4/91、B1648、Aust T、QX和TW等。在中國，主要流行的基因型包括GI-7、GI-13、GI-19、GI-22、GI-28和GVI-1。作為一種冠狀病毒，IBV頻繁發生突變、重組和插入事件，導致顯著的抗原變異和不同毒株間交叉保護效果不佳。近年來，大量研究表明IBV的持續進化導致了全球范圍內各種重組毒株的出現，即使在已接種疫苗的雞群中也不例外。這些遺傳動態與復雜的疫苗接種策略相結合，常常導致免疫失敗，使疾病防控日益困難。

在中國，控制IBV的疫苗接種策略高度異質且存在地區差異。肉雞生產周期短，通常接種減毒活IBV疫苗，而種雞和蛋雞則常規免疫減毒活疫苗和滅活IBV疫苗。此外，IBV免疫程序通常涉及多種IBV血清型的組合。同時，IBV疫苗也常與新城疫病毒（NDV）疫苗聯合使用，這進一步使免疫程序復雜化，并給IBV疫苗的研究，特別是在確保其質量、穩定性、安全性和效力方面帶來了更多挑戰。

為應對這些挑戰，本研究旨在通過臨床觀察、病理學評估、系統發育和重組分析，對2023年獲得的兩株IBV分離株進行表征。這些結果將為了解4/91樣IBV變異的分子進化和流行病學動態提供有價值的見解，并強調持續基因組監測、疫苗設計和免疫策略以改善家禽疾病控制的必要性。

樣本采集和動物實驗經南京農業大學機構動物護理與使用委員會（IACUC）批準，并按照批準的指南進行。

樣本采集自江蘇和安徽省發生臨床疾病的肉雞場，這些雞群在接種H120疫苗后出現了采食量減少、咳嗽和高死亡率等癥狀。收集患病雞的氣管和腎臟用于病毒分離。

病毒分離如前所述進行。簡單來說，采集的氣管和腎臟樣本分別勻漿并通過無菌濾器過濾，然后接種于9–10日齡的無特定病原體（SPF）雞胚中。胚胎在37°C下培養144小時并每天照蛋觀察。如果雞胚出現發育遲緩和卷曲等典型病變，則認為樣本對IBV呈陽性。IBV陽性樣本在滴定前于SPF雞胚中進行三次盲傳；隨后再進行兩次傳代以制備用于動物攻毒的病毒。使用Reed-Muench方法測定病毒的50%雞胚感染劑量（EID₅₀）。

使用TRIzol試劑從樣本中提取總RNA。使用PrimeScript IV第一鏈cDNA合成試劑盒合成互補DNA（cDNA）。隨后使用IBV特異性引物進行PCR擴增。此外，還檢測了病毒懸液，以排除與其他常見禽類病原體的共感染。

IBV的透射電子顯微鏡觀察如前所述進行。將病毒懸液滴加至150目碳膜銅網上，吸附后用2%磷鎢酸負染，干燥后在透射電鏡下觀察。

使用7日齡SPF雞評估分離株的致病性。30只SPF雞隨機分為三組：兩個感染組和一個對照組。感染組雞通過鼻內和眼內途徑接種0.2 mL病毒懸液，對照組接種等體積的磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）。每天觀察所有動物的臨床癥狀、發病率和死亡率。感染后第14天對所有存活雞進行安樂死。

每組使用15只SPF雞進行氣管纖毛活性測定。在感染后3、7和14天，每個時間點安樂死5只雞，測定其氣管纖毛活性。將氣管浸入DMEM中，切成2 mm環，隨機選取10個環在顯微鏡下觀察。纖毛活性評分如下：0 = 100%活性，1 = 76%–99%，2 = 51%–75%，3 = 26%–50%，4 = 0%–25%。10個環的平均分代表每只雞的纖毛損傷指數。同時收集氣管、肺和腎臟組織，固定、脫水、石蠟包埋、切片并進行H&E染色，用于病理組織學觀察。

使用23對引物通過RT-PCR進行全基因組測序。PCR產物純化后克隆至pEASY-Blunt克隆載體中，轉化后進行測序。使用SnapGene組裝和編輯測序結果，重建病毒基因組序列。

從NCBI GenBank下載代表性IBV基因型（GI-GVII）的基因組序列。使用ClustalW進行多序列比對，并重建系統發育樹。分析的基因組區段包括結構蛋白基因（S1、S2、E、M和N）和非結構蛋白基因（1a、1ab、3a、3b、5a和5b）。

使用SimPlot v3.5.1進行Bootscan重組分析，參數設置為：窗口大小200 bp，步長20 bp，100次bootstrap重復，Kimura雙參數模型，轉換/顛換比=2.0，采用鄰接法構建樹。使用RDP v5.74進一步確認檢測到的重組信號，并定位重組斷點。

為了闡明不同IBV基因型之間的結構差異，對分離株和參考疫苗株的S1蛋白序列進行同源建模。建模使用SWISS-MODEL服務器，以IBV刺突蛋白的晶體結構為模板。使用PyMOL v3.1.1可視化和比對預測的三維結構，以比較分離株與疫苗株之間的構象差異。

本研究從臨床樣本中分離出兩株IBV毒株，并在雞胚尿囊液中連續傳代五次。通過特異性引物的RT-PCR確認了兩株分離株，并分別命名為CK/CH/JS/2302和CK/CH/AH/2307。這兩株病毒接種9–10日齡SPF雞胚后均誘導了典型的病變。接種CK/CH/JS/2302的雞胚出現發育遲緩和卷曲，而感染CK/CH/AH/2307的雞胚則表現為生長遲緩。透射電鏡觀察病毒懸液，顯示直徑約為80–100 nm的近似球形病毒粒子。

使用7日齡SPF雞評估分離株的致病性。感染后雞只表現出嗜睡、流鼻液和頻繁甩頭，嚴重情況下進展為咳嗽和喘氣。?^??p< 0.01; ^???p< 0.001.">

CK/CH/JS/2302組約20%的雞在感染后第3天表現出抑郁和嗜睡，在第5-6天增加至30%，隨后在第13天逐漸恢復正常。相比之下，CK/CH/AH/2307組僅有一只雞在第4和第7天出現類似癥狀。超過50%的雞在感染后第1天出現頻繁甩頭，第2天即恢復，這可能與鼻內和眼內接種引起的短暫刺激有關。從第3天起，兩個感染組的雞都出現了反復癥狀，并在第6天達到高峰。除了頻繁甩頭外，還觀察到流鼻液。值得注意的是，CK/CH/JS/2302組的雞表現出更高的發病率和更長的癥狀持續時間，持續到第13天，而CK/CH/AH/2307組的雞在第10天即恢復。當流鼻液加重且未能緩解時，雞只進展為咳嗽和喘氣。約30%的CK/CH/JS/2302組雞表現出這些呼吸道癥狀，其中一只在第5天死亡，死亡率為10%。對死雞的剖檢顯示氣管黏膜有瘀點狀出血并伴有管腔內漿液性滲出，以及腎臟腫脹、蒼白和呈斑駁狀。相比之下，CK/CH/AH/2307組僅有一只雞在第3天出現輕微咳嗽，未觀察到死亡。這些雞的剖檢僅顯示輕微的腎臟腫脹。

感染后第14天，在60%的CK/CH/JS/2302組雞中觀察到以瘀點狀出血為特征的氣管病變，其中四只還表現出氣管管腔內有漿液性滲出。此外，該組70%的雞出現腎臟腫脹，其中四只表現出蒼白斑駁的腎臟。相比之下，CK/CH/AH/2307組僅有40%的雞表現出輕微的腎臟腫脹，20%的雞在氣管黏膜上顯示有限的瘀點狀出血。

在感染后3、7和14天評估氣管纖毛活性。兩組雞的纖毛均在感染后第7天出現顯著損傷。然而，到感染后第14天，氣管纖毛運動恢復到與對照組相同的水平。

感染后第7天采集的組織進行了組織病理學檢查。在CK/CH/JS/2302組，觀察到氣管上皮出血和炎性細胞浸潤，伴有纖毛上皮細胞碎裂和脫落。相比之下，CK/CH/AH/2307組的雞僅表現出輕微的炎性細胞浸潤。在CK/CH/JS/2302組雞的肺部，支氣管顯示顯著的黏膜上皮壞死和脫落。支氣管管腔內充滿大量含紅細胞和炎性細胞的滲出物。炎癥從支氣管向周圍組織離心性擴散，累及鄰近肺泡，導致肺泡壁增厚和炎性細胞滲出，符合支氣管肺炎的特征。在腎臟，CK/CH/JS/2302組觀察到廣泛的腎小管上皮細胞變性和壞死，以及出血。而CK/CH/AH/2307組的雞在肺和腎臟均表現出輕微病變。

為了確定分離株的遺傳分類，使用MEGA v11對CK/CH/JS/2302和CK/CH/AH/2307的S1基因序列進行了比對和分析。與NCBI數據庫下載的參考序列進行的系統發育比較表明，兩個分離株都聚集在GI-13基因型內，確認了它們屬于4/91樣毒株的分類。值得注意的是，CK/CH/JS/2302與東南亞參考毒株（如越南分離株IBHM-2021）的親緣關系更近，而CK/CH/AH/2307則與歐洲參考毒株（如UK/2/91和4/91疫苗株）表現出高度相似性。具體來說，CK/CH/AH/2307與IBHM-2021、UK/2/91和4/91疫苗株的S1序列相似性分別為85.5%、96.9%和97.2%，而CK/CH/JS/2302的相應值分別為95.5%、88.9%和89.0%。

基于結構蛋白基因（S2、M、N和E）的系統發育分析揭示了兩株分離株之間不同的進化特征。CK/CH/AH/2307與GI-13（4/91疫苗株）譜系緊密聚類。相比之下，CK/CH/JS/2302的結構蛋白基因顯示出更復雜的進化關系：S2基因與GI-22（LDT3-A）毒株關系更近，M基因與GI-7（GD）毒株聚類，而N和E基因則與包括GI-7（GD）、GI-22（LDT3-A）、GI-19（SD）和GI-13（GD17/04）在內的多個國內譜系表現出相對較近的關系。

對非結構蛋白基因（1a、1ab、3a、3b、5a和5b）的進一步分析揭示了相似的趨勢。CK/CH/AH/2307在系統發育上仍接近GI-13（4/91疫苗株）譜系，而CK/CH/JS/2302則表現出復雜的進化模式。具體來說，1a和5a基因與GI-19基因型（SD）更接近，1ab基因與GVI-1基因型（GX-NN09032）相似度更高，3a基因與GI-19（SD）和GI-13（GD17/04）基因型均相關，而3b基因則與GI-7（GD）基因型聚在一起。

為了調查潛在的重組事件，使用SimPlot v3.5.1進行Bootscan分析，并用RDP v5.74進行驗證。CK/CH/JS/2302在21,000–22,250 bp位置之間與IBV/India/ck/01/23表現出高度相似性。RDP分析顯示，CK/CH/JS/2302中存在一個潛在的重組事件，親本為GX-YL5（GI-19，作為主要親本）和IBV/India/ck/01/23（GI-13，作為次要親本），重組斷點位于核苷酸位置21,145和22,244。相比之下，CK/CH/AH/2307與4/91疫苗株（KF377577.1）表現出高度的序列相似性，尤其是在4,750–10,000、14,000–19,000、22,000–25,750和26,000–27,500等區域。RDP驗證確認，在CK/CH/AH/2307與所有代表性參考毒株之間未檢測到重組事件。

基于結構蛋白（S2、M、E和N）氨基酸序列的系統發育分析表明，CK/CH/AH/2307與4/91疫苗株緊密聚類，而CK/CH/JS/2302則顯示出更復雜的系統發育模式，與多個國內參考毒株共享遺傳關系，包括GI-7（GD）、GI-22（LDT3-A）、GI-19（SD）和GI-13（GD17/04）。

然而，在刺突蛋白S1亞基中檢測到多個氨基酸替換，主要分布在高變區（HVR）。在CK/CH/JS/2302中，在殘基51–87、125–141和279–312處檢測到不同的氨基酸替換，而CK/CH/AH/2307與4/91疫苗株相比顯示出高度的序列保守性。

為了進一步評估S1蛋白的結構影響，使用SWISS-MODEL服務器預測了CK/CH/JS/2302、CK/CH/AH/2307以及常用疫苗株H120和QXL87的三維結構。使用PyMOL進行結構比對和可視化。計算出的均方根偏差（RMSD）值顯示，CK/CH/JS/2302與H120、QXL87和CK/CH/AH/2307的RMSD值分別為0.054、0.079和0.021，表明CK/CH/JS/2302與CK/CH/AH/2307之間具有更高的結構相似性。

IBV因其高度的遺傳多樣性、頻繁的重組、廣泛的組織嗜性以及由此引發的免疫逃逸和新變異株的出現，使其在家禽群中持續存在并造成經濟損失。這些進化動態常常導致疫苗效力降低，使診斷和監測復雜化，并導致疾病難以控制。

本研究從先前接種H120疫苗的肉雞群中分離出兩株IBV野毒株，并通過病理學評估、系統發育和重組分析對其進行了表征。兩株分離株均在SPF雞中引起呼吸道疾病，包括流鼻液、頻繁甩頭、咳嗽和喘氣。然而，CK/CH/JS/2302表現出更高的毒力，導致更長時間的嚴重呼吸道癥狀、10%的死亡率以及氣管瘀點狀出血和腎臟斑駁等病理病變。相比之下，CK/CH/AH/2307僅引起輕微的呼吸道癥狀和輕微的腎臟腫脹。這些結果表明，4/91樣變異株之間存在毒力差異，這與之前關于突變和重組可導致毒力變異的報道一致。

系統發育分析將兩株分離株都歸類為GI-13（4/91樣）基因型。然而，CK/CH/JS/2302顯示出重組事件，其S1基因與越南毒株（IBHM-2021）密切相關，而結構蛋白和非結構蛋白基因則與包括GI-7、GI-19和GI-22在內的多種國內基因型具有更高的同源性。重組分析進一步確定了CK/CH/JS/2302中GX-YL5（GI-19，主要親本）和IBV/India/ck/01/23（GI-13，次要親本）之間的潛在重組事件。這種遺傳交換事件被認為是IBV進化的主要原因，會導致組織嗜性和抗原性改變。與病理學評估一致，CK/CH/JS/2302引起的氣管和腎臟組織損傷與其推測的親本毒株GX-YL5相似。相比之下，CK/CH/AH/2307與4/91疫苗株表現出高度的基因組相似性，并且沒有重組證據。這些特征與其在7日齡SPF雞中相對較低的毒力一致。然而，CK/CH/AH/2307仍然誘導了顯著的氣管纖毛活性損傷，表明其保留了致病潛力，并可能容易繼發感染。鑒于其緊密的遺傳關系，CK/CH/AH/2307可能是4/91疫苗株在中國長期使用后通過遺傳變異進化而來。需要進一步的病理學研究，特別是在1日齡SPF雞中，以闡明其毒力特征。

S蛋白被認為是決定IBV組織和細胞嗜性的主要因素。比較系統發育和結構分析揭示，CK/CH/JS/2302中S1蛋白高變區I-III內的氨基酸替換導致了可能影響受體結合和抗原性的構象變化。結構建模進一步顯示，受體結合域的改變可能影響受體親和力和抗體識別。RMSD值表明，CK/CH/JS/2302與CK/CH/AH/2307具有高度的結構相似性，但與H120和QXL87疫苗株存在差異，這可能意味著有限的交叉保護。總之，基因組、結構和致病性分析共同闡明了在免疫壓力下，遺傳進化、免疫選擇和致病性變異相互作用所塑造的當前流行4/91樣IBV變異株的顯著適應性。

總之，這項研究提供了證據，表明中國的GI-13譜系既包含重組毒株，也包含源自疫苗株的低毒力變異株，反映了同一基因型內不同的進化適應。觀察到的分離株之間不同的致病性和基因組特征說明了IBV的持續進化以及重組與免疫選擇之間的動態相互作用。重要的是，CK/CH/AH/2307與4/91疫苗株不同，并且表現出比CK/CH/JS/2302更低的毒力，這支持了其作為開發針對中國流行4/91樣變異株的下一代疫苗候選毒株的潛力，這些變異株可能更適合中國的田間條件。這些發現強調了持續分子監測和基因型特異性疫苗設計的必要性，以對抗IBV的遺傳和抗原多樣性。基于流行基因型（特別是GI-13）的有效免疫策略，對于增強交叉保護、減少傳染性支氣管炎對家禽生產的經濟影響至關重要。