《Advanced Science》：Antagonistic Ubiquitin Switching by USP7 and RNF40 Orchestrates KDM6A Homeostasis to License Coronavirus Susceptibility
編輯推薦：
這篇研究性論文揭示了一個由泛素化精細調控的宿主-病毒互作新機制。研究團隊發現去泛素化酶USP7通過穩定組蛋白去甲基化酶KDM6A，上調多種冠狀病毒受體（ACE2、DPP4、Ceacam1）表達，從而促進病毒感染；而E3泛素連接酶RNF40則通過K6/K11位點泛素化介導KDM6A的自噬性降解，起到限制病毒感染的作用。該研究將USP7確立為一種廣譜的抗冠狀病毒宿主靶點，其小分子抑制劑在小鼠模型中展現出良好的耐受性和保護效果，為針對當前及未來冠狀病毒威脅提供了新的宿主導向治療策略。
引言
2019冠狀病毒病（COVID-19）大流行持續威脅全球公共衛生。隨著SARS-CoV-2的不斷演變，現有授權疫苗、單克隆抗體及抗病毒藥物的效力有所下降，這凸顯了開發針對當前及新興冠狀病毒的廣譜抗病毒策略的必要性。宿主導向療法因其更高的耐藥遺傳屏障和應對未來冠狀病毒的潛力而備受關注。冠狀病毒感染始于病毒刺突糖蛋白與特定宿主受體的結合，這是病毒生命周期中的關鍵第一步。主要的受體包括介導SARS-CoV、SARS-CoV-2和HCoV-NL63感染的血管緊張素轉換酶2 (ACE2)，介導MERS-CoV感染的二肽基肽酶4 (DPP4)，以及介導小鼠肝炎病毒 (MHV) 感染的癌胚抗原相關細胞黏附分子1 (Ceacam1) 等。越來越多的證據表明，調控這些受體的表達可能是預防冠狀病毒感染的可行策略。
研究表明，表觀遺傳調控因子如組蛋白去甲基化酶KDM6A（也稱UTX），通過調控染色質可及性和增強子激活，在調節冠狀病毒受體表達中扮演核心角色。KDM6A可與賴氨酸甲基轉移酶KMT2D和乙酰轉移酶p300形成復合物，促進受體基因位點的染色質開放。然而，調控KDM6A蛋白質穩態的上游機制尚不清楚。蛋白質穩態對維持正常生理功能至關重要，而泛素化是調節蛋白質穩定性的最重要翻譯后修飾機制之一。去泛素化酶（DUB）通過去除泛素分子來微調蛋白質穩定性和功能。其中，泛素特異性蛋白酶7 (USP7) 是一種廣泛研究的半胱氨酸蛋白酶，在細胞調控中扮演多種角色，并與癌癥、炎癥反應和病毒感染等多種病理過程相關。
本研究旨在揭示一個拮抗性的泛素介導調控環路，該環路動態控制KDM6A的穩定性，從而調控細胞對多種冠狀病毒的易感性。
結果
1. USP7是多種高致病性冠狀病毒感染所必需的
通過CRISPR-Cas9敲除技術構建USP7基因敲除細胞系，研究團隊發現，無論是在猴源細胞（Vero E6）還是人源細胞（Huh7.5）中，失活USP7均能顯著抑制SARS-CoV-2及其報告病毒icSARS-CoV-2-mNG的復制和病毒產量。研究進一步將范圍擴展至其他高致病性冠狀病毒，包括表達SARS-CoV-1刺突蛋白的蝙蝠冠狀病毒HKU5（HKU5-SARS1-S）和MERS-CoV。實驗結果表明，USP7的缺失同樣降低了這些病毒誘導的細胞死亡和病毒復制。通過冠狀病毒刺突蛋白假病毒感染實驗，研究者證實USP7的失活同樣阻斷了SARS-CoV-1、SARS-CoV-2和MERS-CoV的假病毒進入細胞。這些結果共同證明，USP7在高致病性冠狀病毒感染中扮演著關鍵的角色。
2. USP7的去泛素化酶活性是調控ACE2和DPP4表達所必需的
為了探究USP7如何調控病毒進入，研究者首先分析了冠狀病毒受體的表達。基因敲除USP7后，ACE2和DPP4的mRNA水平以及ACE2的蛋白表達均有所下降。為了確定USP7的去泛素化酶活性是否是其促病毒活性所必需的，研究者在USP7敲除細胞中回補了野生型USP7 (WT) 或其去泛素化酶活性失活的突變體 (C223S)。結果顯示，只有回補野生型USP7，而非C223S突變體，才能恢復ACE2和DPP4的表達、SARS-CoV-2的復制、病毒誘導的細胞死亡以及假病毒的進入能力。通過外源性表達人源ACE2和DPP4，可以在USP7敲除細胞中恢復病毒感染和假病毒進入。這些數據證明，USP7以去泛素化酶活性依賴的方式促進高致病性冠狀病毒感染，其機制正是通過調控ACE2和DPP4的表達來實現。
3. USP7對KDM6A進行去泛素化并使其穩定
研究者進一步探究了USP7調控病毒受體的上游靶點。基于已知的ACE2和DPP4的表觀遺傳調控因子，研究者通過免疫共沉淀（Co-IP）實驗發現，USP7與KDM6A和染色質重塑復合物BAF的組分SMARCA4存在相互作用，但與轉錄因子HNF1A和HNF1B無互作。內源性KDM6A也能將USP7拉下。由于USP7失活與KDM6A缺失在抑制冠狀病毒感染方面表型相似，研究者推測USP7可能通過靶向KDM6A來發揮作用。
實驗證實，過表達野生型USP7，而非C223S突變體，能以劑量依賴的方式穩定KDM6A。相反，基因敲除USP7會降低KDM6A蛋白水平，但不影響其mRNA水平。蛋白酶體抑制劑MG-132處理可以恢復USP7敲除細胞中的KDM6A表達，提示USP7可能調控KDM6A的泛素化介導的蛋白酶體降解。泛素化實驗進一步證實，野生型USP7能特異性去除KDM6A上K48連接的多聚泛素鏈，而C223S突變體則無此功能。此外，研究者發現KDM6A蛋白上的賴氨酸位點K29、K299和K1315（3KR突變體）對其泛素化至關重要，3KR突變體對USP7介導的去泛素化和穩定作用不敏感。
為了確認USP7是否通過KDM6A調控病毒感染，研究者在KDM6A敲除細胞中再次敲除USP7，發現雙敲細胞與KDM6A單敲細胞在病毒復制抑制程度上相似，表明USP7的促病毒活性確實通過KDM6A介導。在USP7敲除細胞中回補KDM6A的3KR（泛素化抗性）突變體，而非野生型KDM6A，能夠恢復ACE2和DPP4的表達以及假病毒感染。此外，USP7的缺失減少了KDM6A在ACE2基因啟動子和增強子區域的富集，同時也降低了這些區域的活躍增強子標記H3K27ac的水平。綜上所述，USP7通過去泛素化并穩定KDM6A來促進高致病性冠狀病毒感染，而KDM6A的正常招募和功能對于病毒受體基因位點的調控至關重要。
4. RNF40泛素化并降解KDM6A以限制病毒感染
為了解KDM6A穩態的另一面，研究者著手尋找介導其降解的E3泛素連接酶。通過分析KDM6A互作蛋白組數據，篩選出三個候選E3連接酶RNF40、HUWE1和KCMF1。互作實驗確認KDM6A與RNF40和KCMF1存在關聯，內源性RNF40也能將KDM6A拉下。功能實驗表明，過表達RNF40（而非其伴侶RNF20或KCMF1）能以劑量依賴的方式降低KDM6A的穩定性。缺失其E3連接酶活性所必需的RING結構域（ΔRING突變體）會損害RNF40與KDM6A的結合及其降解KDM6A的能力。泛素化實驗證實，野生型RNF40能促進KDM6A的多聚泛素化，而ΔRING突變體則不能，且RNF40催化的是K6和K11連接的多聚泛素化。在RNF40敲除細胞中，KDM6A的K6和K11連接泛素化被顯著削弱。
在Huh7.5細胞中敲除RNF40（而非KCMF1）能顯著提高KDM6A蛋白水平（但不影響mRNA），并上調ACE2和DPP4的mRNA表達，同時促進SARS-CoV-1、SARS-CoV-2和MERS-CoV假病毒進入。在RNF40敲除細胞中回補野生型RNF40，而非ΔRING突變體，可以恢復對KDM6A的降解、下調ACE2和DPP4的表達，并抑制多種冠狀病毒假病毒感染。這表明RNF40通過泛素化并降解KDM6A來限制病毒感染。
5. RNF40通過TAX1BP1介導的自噬降解KDM6A
研究者進一步探究了RNF40降解KDM6A的具體途徑。通過抑制劑處理發現，自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3MA）和溶酶體抑制劑NH4Cl能恢復RNF40介導的KDM6A降解，而蛋白酶體抑制劑MG132則無此效果。在關鍵自噬蛋白ATG5和/或ATG7缺陷的細胞中，RNF40介導的KDM6A降解也被恢復，證明降解是通過自噬-溶酶體途徑進行的。
自噬通常由自噬受體識別被泛素標記的“貨物”而啟動。互作篩選發現，KDM6A與自噬受體TAX1BP1特異性結合，而RNF40也與TAX1BP1強烈互作。有趣的是，過表達野生型RNF40（而非ΔRING突變體）能促進KDM6A與TAX1BP1的關聯，而RNF40缺陷則會削弱這種關聯。過表達TAX1BP1能降低KDM6A蛋白水平，且該效應可被自噬抑制劑而非蛋白酶體抑制劑逆轉。在TAX1BP1缺陷細胞中，RNF40無法有效降解KDM6A。體外結合實驗進一步證明，TAX1BP1特異性識別并結合被K6/K11連接泛素鏈修飾的KDM6A。
最后，在Huh7.5細胞中敲除TAX1BP1，會導致KDM6A和ACE2蛋白水平升高，上調ACE2和DPP4的mRNA表達，并促進多種冠狀病毒假病毒的進入和復制。綜上，RNF40通過催化KDM6A的K6/K11位點泛素化，使其被TAX1BP1識別，進而經由自噬途徑降解，從而限制病毒感染。
6. 抑制USP7可消除多種病毒受體表達并阻斷病毒感染
為了評估靶向USP7的治療潛力，研究者使用了強效且選擇性的USP7催化抑制劑FT671。在Vero E6細胞中，FT671以劑量和時間依賴的方式抑制ACE2和DPP4的mRNA和蛋白表達，并劑量依賴地抑制SARS-CoV-2原型的細胞病變效應和假病毒進入。在人源細胞Huh7.5和Calu-3中也觀察到ACE2表達的抑制。為了驗證抑制劑的特異性，研究者使用了另一種結構不同的不可逆USP7抑制劑XL177A，得到了相似的結果。更重要的是，在KDM6A敲除細胞中，FT671和XL177A均無法再下調病毒受體表達或抑制病毒感染，這從遺傳學上證明了USP7抑制劑的作用依賴于KDM6A。
鑒于USP7-KDM6A軸也調控MHV受體Ceacam1，研究者在鼠源小膠質細胞BV2中進行了實驗。結果顯示，FT671或XL177A處理能劑量依賴地抑制Ceacam1表達和MHV-3的感染及假病毒進入。
7. 抑制USP7可在原代人細胞中阻斷SARS-CoV-2和MERS-CoV感染
為了在生理相關模型中評估療效，研究者在氣液界面培養的原代人支氣管上皮細胞（HBECs）中進行了實驗。FT671處理降低了HBECs中ACE2和DPP4的表達，并抑制了SARS-CoV-2和MERS-CoV的病毒復制和產量，但對甲型流感病毒（IAV）的復制無影響，提示USP7抑制劑具有一定病毒特異性。
研究者進一步測試了FT671對多種SARS-CoV-2關切變異株（VOC）以及對直接作用抗病毒藥（如瑞德西韋）耐藥病毒的效果。FT671對包含RdRp突變E802D的瑞德西韋耐藥毒株表現出比瑞德西韋本身更好的抑制效果，并且能有效抑制Alpha (B.1.1.7)、Beta (B.1.351)、Gamma (P.1)、Delta (B.1.617.2) 和Omicron (B.1.1.529) 等多種變異株的感染。此外，在3D培養的原代人腸道類器官（HIEs）中，FT671預處理同樣降低了ACE2和DPP4的表達，并抑制了SARS-CoV-2和MERS-CoV的感染。
8. 抑制USP7可降低小鼠體內KDM6A表達和病毒感染
最后，研究者在C57BL/6J小鼠體內評估了USP7抑制劑的治療潛力。以15 mg/kg的劑量腹腔注射FT671，連續5天，未引起小鼠顯著的體重下降，表明耐受性良好。FT671處理降低了小鼠小腸、脾臟、肝臟和肺組織中的KDM6A蛋白水平。同時，多個組織（脾、肝、肺）中MHV受體Ceacam1的mRNA表達也相應下降。與受體表達下降一致，FT671處理顯著保護了小鼠免受MHV-A59感染，表現為感染后3天，脾臟、肝臟和肺組織中的病毒載量顯著降低。
討論
本研究揭示了一個以KDM6A穩定性為中心、由泛素化精細調控的環路，該環路決定了細胞對多種冠狀病毒的易感性。USP7通過去除K48連接的多聚泛素鏈來穩定KDM6A，從而上調多種冠狀病毒受體的表達并促進病毒進入。相反，E3泛素連接酶RNF40則通過催化K6和K11連接的泛素化，招募選擇性自噬受體TAX1BP1，觸發KDM6A的自噬性降解，從而限制病毒感染。這種拮抗性開關的存在，強調了細胞需要動態、精確地控制KDM6A蛋白水平，以平衡病毒感染與可能的免疫病理反應。
除了通過受體表達促進病毒感染外，USP7和RNF40可能還通過調控免疫信號通路（如I型干擾素和NF-κB通路）影響抗病毒防御，這為USP7抑制劑的廣譜抗病毒效應提供了更多解釋。本研究發現的RNF40驅動的、TAX1BP1介導的KDM6A自噬性降解，為理解病毒-宿主相互作用以及非蛋白酶體依賴的泛素化功能提供了新范式。
USP7和RNF40本身也受到轉錄和翻譯后水平的嚴格調控，形成了一個復雜的調控網絡，使細胞能夠響應包括病毒感染在內的各種信號，精確平衡KDM6A穩態。值得注意的是，USP7和KDM6A在多種癌癥和發育障礙中常發生突變，其功能具有雙重性。因此，靶向該軸進行治療時，需要仔細評估組織特異性效應和潛在長期影響。冠狀病毒受體在特定組織中的限制性表達可能為此提供了一個治療窗口。FT671在小鼠中的良好耐受性以及在原代人細胞中的高效抗病毒活性，突顯了其治療潛力。
總之，本研究揭示了一個精妙平衡的泛素化調控環路，它控制著KDM6A的穩定性，并主導細胞對多種冠狀病毒的易感性。靶向該軸，特別是抑制USP7，為應對當前及未來的冠狀病毒威脅提供了一種有前景的廣譜策略。
