《Advanced Science》：Liposomal Nanoconfinement Enables Type I Photodynamic Conversion for Synergistic Cancer Photothermal-Immunotherapy
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本文介紹了一種多功能納米平臺（RhM-R837@Lip），該平臺通過脂質體納米限域將光敏劑RhM從II型光動力治療（PDT）機制轉換為I型PDT，顯著抑制單線態氧（1O2）生成并增強超氧陰離子（O2•?）和羥基自由基（•OH）產生，同時實現高達56.1%的光熱轉換效率。共載免疫佐劑R837進一步刺激全身免疫應答，協同增強腫瘤根除效果，為克服腫瘤缺氧微環境和抑制轉移提供了創新策略。
摘要
本研究開發了一種新型的基于半花菁衍生物的脂質體納米組裝體——RhM-R837@Lip，旨在實現協同的光動力、光熱和免疫治療。該平臺通過脂質體納米限域作用，將光敏劑RhM從傳統的II型光動力治療（PDT）機制高效地轉換為I型PDT機制，從而更適用于缺氧的腫瘤微環境。
引言
光療法作為一種非侵入性、時空精度高的癌癥治療方式受到廣泛關注。然而，傳統的II型PDT嚴重依賴氧氣，在腫瘤缺氧環境下療效受限。相比之下，I型PDT通過電子或氫原子轉移過程產生活性氧（ROS），如超氧陰離子（O2•?）、過氧化氫（H2O2）和羥基自由基（•OH），對缺氧腫瘤展現出優勢。同時，光熱治療（PTT）利用光熱劑（PTAs）將光能轉化為局部熱量，誘導細胞凋亡或壞死。將I型PDT與PTT結合，并與免疫療法協同，有望實現對腫瘤的有效消融并激發全身性抗腫瘤免疫。
RhM-R837@Lip的制備與表征
研究人員合成了一種具有給體-π-受體（D-π-A）結構的半花菁染料RhM，并通過薄膜水化法將其裝載入脂質體（RhM@Lip）。隨后，利用pH梯度法遠程裝載Toll樣受體（TLR）7/8激動劑咪喹莫特（R837），最終形成多功能納米組裝體RhM-R837@Lip。
動態光散射（DLS）和透射電子顯微鏡（TEM）顯示，RhM-R837@Lip形成平均直徑約130納米的球形囊泡。紫外-可見光譜顯示，游離的RhM在水溶液中容易自聚集，最大吸收峰在740納米；而RhM@Lip和RhM-R837@Lip在磷酸鹽緩沖液（PBS）中的最大吸收峰紅移至840納米，表明脂質體為RhM提供了疏水性微環境，使其保持良好的近紅外（NIR）光學特性。其摩爾消光系數達到5.91×104M-1cm-1，約為游離RhM的兩倍。
體外光物理性質
在808納米激光照射下，RhM@Lip和RhM-R837@Lip在10分鐘內可引起約25°C的溫升，顯著高于游離RhM（18°C），其光熱轉換效率高達56.1%，且具有良好的光熱穩定性。使用特異性熒光探針檢測ROS生成：游離RhM顯示出強烈的單線態氧（1O2）信號，而RhM@Lip和RhM-R837@Lip的1O2生成被顯著抑制。相反，RhM-R837@Lip顯著增強了羥基自由基（•OH）和超氧陰離子（O2•?）的生成。電子自旋共振（ESR）光譜進一步證實，脂質體包裹后，RhM從II型PDT機制轉變為以自由基介導為主的I型PDT機制。
體外細胞攝取與亞細胞定位
RhM-R837@Lip主要通過能量依賴性的網格蛋白介導的內存作用進入4T1細胞。共定位實驗表明，其熒光信號與溶酶體示蹤劑LysoTracker Green高度重合，說明納米顆粒主要積累在溶酶體中。時間依賴性攝取實驗顯示，細胞內熒光強度在孵育12小時達到峰值。
體外抗腫瘤活性
通過CCK-8實驗評估了不同制劑對多種腫瘤細胞系的細胞毒性。在808納米激光照射下，RhM@Lip和RhM-R837@Lip表現出顯著的、濃度依賴性的細胞殺傷作用，而R837@Lip及未經光照的組別則無明顯毒性。流式細胞術分析顯示，RhM-R837@Lip + 激光處理誘導了最高比例的晚期凋亡或繼發性壞死。使用DCFH-DA探針檢測細胞內總ROS水平，證實光照后ROS顯著增加。進一步的探針實驗（HPF、DHE、SOSG）和活/死細胞染色、線粒體膜電位（MMP）檢測均證實，RhM-R837@Lip主要通過I型PDT機制殺傷腫瘤細胞。
體外免疫應答
RhM-R837@Lip在激光照射下能夠有效誘導免疫原性細胞死亡（ICD）。免疫熒光和酶聯免疫吸附試驗（ELISA）結果顯示，與對照組相比，RhM-R837@Lip + 激光處理顯著增強了鈣網蛋白（CRT）在細胞表面的暴露，促進了高遷移率族蛋白B1（HMGB1）從細胞核向胞質的轉位和釋放，并增加了細胞外三磷酸腺苷（ATP）的分泌。這些損傷相關分子模式（DAMPs）的釋放有利于激活后續的免疫反應。
體內抗腫瘤效應
在4T1原位腫瘤模型中，尾靜脈注射熒光標記的RhM-R837@Lip-Cy7后，腫瘤部位的熒光信號在12小時達到最強，表明其具有良好的腫瘤靶向性和富集能力。體內光熱成像顯示，注射RhM-R837@Lip并照射激光后，腫瘤部位溫度在5分鐘內升高約13.5°C。在14天的治療期間，RhM-R837@Lip + 激光組對腫瘤生長的抑制效果最為顯著。蘇木精-伊紅（H&E）染色和Ki-67免疫組化分析進一步證實了其強大的腫瘤消融能力和抑制細胞增殖的作用。此外，該治療還成功在體內誘導了ICD，并促進了CD3+/CD4+和CD3+/CD8+T細胞在腫瘤組織的浸潤。
體內系統性抗腫瘤免疫反應
流式細胞術分析顯示，與對照組或單一療法組相比，RhM-R837@Lip + 激光處理能更有效地促進引流淋巴結和腫瘤內樹突狀細胞（DCs）的成熟（CD80+/CD86+）。同時，該療法顯著提高了脾臟和腫瘤中CD3+/CD4+和CD3+/CD8+T細胞的比例，減少了腫瘤內調節性T細胞（Tregs）的數量，并上調了促炎細胞因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和干擾素-γ（IFN-γ）的水平。這些結果表明，RhM-R837@Lip介導的療法能夠有效激活全身性抗腫瘤免疫應答。
對遠端腫瘤的抑制作用
在建立了原發性腫瘤后，于對側接種4T1細胞形成遠端腫瘤模型。實驗結果表明，經RhM-R837@Lip + 激光治療原發灶后，遠端腫瘤的生長受到顯著抑制，其體積和重量均遠小于對照組。免疫熒光分析顯示，在遠端腫瘤中也觀察到了CD4+和CD8+T細胞浸潤的增加，證明了該療法能夠產生“遠隔效應”，激發系統性免疫以抑制轉移灶。血清生化分析和主要器官的H&E染色未發現明顯異常，證實了RhM-R837@Lip的系統給藥具有良好的生物安全性。
結論
本研究成功構建了集I型PDT、PTT和免疫療法于一體的多功能脂質體納米平臺RhM-R837@Lip。該平臺通過脂質體納米限域作用，將光敏劑RhM從II型PDT高效轉換為I型PDT，顯著增強了自由基的產生并抑制了1O2生成，同時實現了高達56.1%的光熱轉換效率。共載的免疫佐劑R837協同光療誘導的ICD，共同激活了強大的全身性抗腫瘤免疫，不僅有效消融了原位腫瘤，還抑制了遠端轉移瘤的生長。這項工作為克服腫瘤缺氧微環境、實現高效的PDT和抑制腫瘤轉移提供了一種創新的、具有廣闊應用前景的策略。
